HB-EGF对HSC-T6细胞Ras/ERK通路的激活及对MMP-2、TIMP-1表达的影响

张莉娟， 何彬彬， 黄月红， 陈治新， 王小众



HB-EGF对HSC-T6细胞Ras/ERK通路的激活及对MMP-2、TIMP-1表达的影响

张莉娟， 何彬彬， 黄月红， 陈治新， 王小众

目的观察肝素结合性表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)激活肝星状细胞(HSC)过程中Ras/ERK信号通路的变化和对金属基质蛋白酶(MMP)及其抑制物的影响。方法传代培养HSC-T6细胞，分空白对照组、HB-EGF处理组(20，40，80 ng/mL)，采用QRT-PCR法检测MMP-2、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)及表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达，并确定HB-EGF刺激HSC-T6 Ras/ERK通路(ERK1、ERK2、P38MAPK)活化的最佳浓度及最佳时间，检测该通路活化情况。结果QRT-PCR检测提示,MMP-2的表达随HB-EGF干预时间的延长增加，TIMP-1的表达随干预时间的延长递减；40 ng/mL HB-EGF培养HSC-T6 48 h后，EGFR mRNA的表达较空白对照组明显上调(P<0.05)；选择40 ng/mL HB-EGF培养48 h为最佳刺激时间与浓度，该处理组ERK1 mRNA的表达较空白对照组明显上调(P<0.05)，但ERK2、P38MAPK的变化无统计学意义；Western-blot检测提示该处理组ERK1蛋白的表达较空白对照组上调(P<0.05)。结论HB-EGF可影响HSC-T6的MMP-2、TIMP-1的表达；HB-EGF通过促进HSC-T6表达EGFR、ERK1，有效激活细胞内Ras/ERK信号通路。

表皮生长因子； 肝素； 肝细胞； 星形细胞； 大鼠； 细胞外信号调节MAP激酶类； RAS蛋白质类； 胞间信号肽类和蛋白质类； 基质金属蛋白酶类； 金属蛋白酶1组织抑制剂

肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)为间质来源的一种肝脏非实质细胞，它的活化与增殖是肝纤维化形成的中心环节，是分泌金属蛋白酶及其抑制物的主要细胞，参与调节肝脏的胶原代谢[1]。HSC活化后，多种细胞因子分别结合HSC上的特异性受体，激活胞内PI3-Akt、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等信号转导通路[2]。已有研究发现，HSC内活化的ERK信号通路参与调控细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成及降解过程，包括促进Ⅰ、Ⅲ胶原合成，抑制金属基质蛋白酶-1(matrix metalloproteinase, MMP-1)、促进金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase-1、2，TIMP-1、TIMP-2)的表达[3-4]。但HSC活化后，ERK通路调控MMP及其抑制物的具体机制还未完全阐明。

肝素结合性表皮生长因子样生长因子(heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF)为表皮生长因子家族中的一员，具有高度肝素亲和力。细胞内HB-EGF可受到肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(inter leukin,IL-1β)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor subunit β,PDGFβ)等多种细胞因子的诱导表达[5]，并通过结合表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)和ErbB4，激活胞内多条信号转导通路，促进血管平滑肌细胞、肝细胞及成纤维细胞等的分裂增殖[6]。笔者以不同浓度的HB-EGF刺激HSC-T6细胞系，观察HB-EGF对HSC的ERK通路活化情况，同时检测MMP-2、TIMP-1蛋白的表达，探讨HB-EGF及ERK通路的激活对HSC胶原代谢的影响。

1　材料与方法

1.1材料HSC-T6(湘雅细胞库)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)；HB-EGF试剂(美国Peprotech公司)；Trizol试剂(深圳生物晶美公司)；MMLV逆转录酶(美国Promega公司)；RNase Inhibitor、SYBR®Premix Ex Taq(日本Takara公司)；预染蛋白质分子量标准(HOU-BIO科技有限公司)；兔抗ERK1/2单克隆抗体(美国CST公司)；兔抗MMP-2多克隆抗体(美国Abcam公司)；兔抗TIMP-1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；小鼠抗GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(中杉金桥生物技术有限公司)；定量PCR仪(德国Eppendorf公司)；快速蛋白转运系统PIERCEG2(美国Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1细胞传代培养用含10%FBS的高糖DMEM培养基培养HSC-T6，平均每3天消化传代1次，1∶3传代，取第3～5代细胞用于实验。

1.2.2细胞接种与分组以2×105mL-1的密度接种于6孔板，24 h后换含2%FBS的高糖DMEM同步化24 h后进行分组实验：空白对照组(3 mL含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基)、处理组 Ⅰ(HB-EGF 20 ng/mL)、处理组Ⅱ(HB-EGF 40 ng/mL)、处理组Ⅲ(HB-EGF 80 ng/mL)，分别培养24，48 h。

1.2.3检测HSC-T6的TIMP-1、MMP-2的表达

1.2.3.1QRT-PCR法按试剂盒说明操作，抽提各孔HSC-T6的总RNA，用紫外分光光度法测定RNA含量及纯度，A260/A280为1.8～2.1，用无核酶水调整RNA浓度为400～1 000 ng/mL；cDNA的合成采用25 mL体系，每一体系含1.5 μg样品RNA，0.5 μg random primer(N9)，终浓度0.4 mmol dNTP，70 ℃变性5 min；每一扩增管中再依次加入5×MMLV Buffer 5 μL，dNTP Mixture 5 μL，MMLV逆转录酶1 μL，RNase A inhibitor 0.5 μL，37 ℃，60 min→70 ℃变性5 min，使MMLV逆转录酶失活；加入1 μL RNase H，37 ℃反应30 min→70 ℃变性5 min；加入174 μL TE(pH 8.0)，混匀后于-80 ℃保存；荧光实时定量PCR：采用Takara公司的SYBR®Premix Ex Taq试剂，配置20 μL反应体系，含2X SYBR Green master mix 10 μL，Primer mix 0.2 mL，Sterile water 4.8 μL，cDNA 模板5 μL→95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s→63 ℃退火15 s→72 ℃延伸20 s，45个循环后进行融解曲线程序。以管家基因GAPDH作为内参，QRT-PCR结果通过2-△△Ct法计算不同处理组目的基因的mRNA相对表达水平。

1.2.3.2Western-blot法HB-EGF培养HSC-T6 24及48 h后，按1×106μL-1细胞加入100 μL细胞裂解液于6孔板，收集细胞及裂解液至EP管，冰上裂解30 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清液至另一EP管中，按照BCA蛋白定量法测定样品蛋白浓度；以5×上样缓冲液、RIPA配置40 μg蛋白上样量于PCR管中，混匀后沸水中变性5 min；配制10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，上样、电泳，转膜；将硝酸纤维素(nitrocellulosefilter membrane, NC)膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温封闭2 h；兔抗MMP-2多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗TIMP-1多克隆抗体(1∶300)、小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃摇床过夜；用TBST洗膜3次(各10 min)，与相应辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)孵育2 h后，TBST洗膜3次(各10 min)；滴加ECL荧光液于NC膜上，暗室显影、扫描，Gel Doc 100凝胶图像分析仪分析，蛋白表达水平以目标蛋白与内参GAPDH吸光度值比值表示。

1.2.4QRT-PCR法检测HSC-T6 EGFR的表达步骤及反应条件参照1.2.3.1。

1.2.5QRT-PCR法、Western-blot法检测HSC-T6 ERK1、ERK2的表达步骤及反应条件参照1.2.3.1及1.2.3.2；兔抗Erk1/2单克隆抗体(1∶1 000)，小鼠抗GAPDH单克隆抗体(1∶1 000)，羊抗兔或羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)。

1.3统计学处理应用SPSS统计软件分析。2组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P<0.05为差别有统计学意义。

2　结　果

2.1 HB-EGF对HSC-T6细胞中MMP-2、TIMP-1表达的影响QRT-PCR和Western-blot法分别检测各浓度HB-EGF(20,40,80 ng/mL)对HSC-T6细胞中MMP-2、TIMP-1的mRNA和蛋白表达。HB-EGF作用48 h后，各组MMP-2的表达随培养时间延长而增加，而TIMP-1的表达则随时间延长而逐渐下降(P<0.05)。但HB-EGF的不同作用浓度之间MMP-2的表达差别无统计学意义(P>0.05)。48 h后，处理组Ⅰ、 Ⅲ的TIMP-1表达较处理组Ⅱ明显下调(P<0.05)，MMP-2、TIMP-1蛋白的表达与mRNA的表达情况基本一致(表1，2及图1，2)。

2.2HB-EGF对HSC-T6细胞中EGFR表达、Ras/ERK信号通路的影响QRT-PCR法检测HB-EGF对HSC-T6细胞中EGFR表达的影响， 处理组Ⅱ中的HSC-T6细胞EGFR mRNA的表达较空白对照组明显上调(表3，图3)。

2.3HB-EGF对HSC-T6细胞中Ras/ERK信号通路的影响QRT-PCR法和Western-blot法检测HSC-T6细胞中Ras/ERK信号通路中ERK1、ERK2基因的mRNA及蛋白的表达水平。HB-EGF 40 ng/mL处理48 h后，ERK1的mRNA表达较空白对照组明显上调，ERK2无明显变化(P<0.05，表4,图4)；Western-blot检测可见ERK1蛋白的表达较空白对照组明显上调(表5,图5)。

Tab 1The expression of MMP-2，TIMP-1 mRNA in all groups

HB-EGF：肝素结合性表皮生长因子样生长因子； MMP-2：金属基质蛋白酶-2； TIMP-1：金属蛋白酶组织抑制剂-1.Ⅰ组：HB-EGF 20 ng/mL组； Ⅱ组：HB-EGF 40 ng/mL组； Ⅲ组：HB-EGF 80 ng/mL组.与同组24 h比较，△:P<0.05.

表2各组MMP-2、TIMP-1基因蛋白的相对表达

Tab 2The expression of MMP-2,TIMP-1 protein in all groups

HB-EGF：肝素结合性表皮生长因子样生长因子； MMP-2：金属基质蛋白酶-2； TIMP-1：金属蛋白酶组织抑制剂-1.Ⅰ组：HB-EGF 20 ng/mL组； Ⅱ组：HB-EGF 40 ng/mL组； Ⅲ组：HB-EGF 80 ng/mL组.与同组24 h比较，△：P<0.05.

Ⅰ组：HB-EGF 20 ng/mL组； Ⅱ组：HB-EGF 40 ng/mL组； Ⅲ组：HB-EGF 80 ng/mL组.EGFR：表皮生长因子受体； HB-EGF：肝素结合性表皮生长因子样生长因子； HSC-T6:肝星状细胞.与空白对照组比较，△：P<0.05.

表448 h ERK1、ERK2基因mRNA的相对表达

Tab 4The expression of ERK1 and ERK2 mRNA in 48 h group

ERK：细胞外信号调节激酶； HB-EGF：肝素结合性表皮生长因子样生长因子.与空白对照组比较，△：P<0.05.

Tab 5The expression of ERK1 and ERK2 protein in all group

ERK：细胞外信号调节激酶； HB-EGF:肝素结合性表皮生长因子样生长因子.与空白对照组比较，△：P<0.05.

3　讨　论

肝纤维化的主要病理基础是ECM的合成与沉积，而调控ECM合成与降解平衡的关键分子是HSC分泌的MMPs及其TIMPs，二者的动态平衡与肝纤维化的发生发展密切相关。ERK/MAPK信号通路由MAPKKK、MAPKK、MAPK顺序活化的级联反应，主要通过Ras-Raf-MEK-ERK激活，是多种细胞因子向细胞内传递信号的重要通路之一，参与了急性肝损伤、肝纤维化、肝脏肿瘤等多种肝脏疾病的发生发展。

本研究证实，HB-EGF(40 ng/mL)能够促进HSC-T6细胞表达EGFR、ERK1，刺激Ras/ERK信号通路的活化。同时本研究还检测不同浓度HB-EGF对HSC-T6细胞MMP-2、TIMP-1表达的影响，发现HSC-T6细胞MMP-2的表达随培养时间的延长而表达增加，TIMP-1随培养时间的延长而表达下降，HB-EGF 20,80 ng/mL组较40 ng/mL处理组数值明显下调，但是各浓度HB-EGF处理组与空白对照组比较均无统计学意义。丁倩等的研究结果显示，HB-EGF能够促进HSC(LX-2细胞株)表达TIMP-1[7]。本结果提示，HB-EGF诱导的Ras/ERK通路的活化对HSC-T6的MMP-2、TIMP-1表达有影响，与其不一致，考虑可能是实验条件、细胞株的选择的不同等原因引起的差异。

目前认为HSC胞内ERK信号通路激活后，活化的ERK转入胞核，与核转录因子c-fos、c-jun、stat、核因子IL-6结合并使其磷酸化，同时介导细胞周期蛋白D、E的表达，促进细胞增殖[8-9]，并调控其表型发生转变，抑制HSC凋亡[9-10]。ERK是MAPK家族中的丝氨酸/苏氨酸激酶，分子量约42～44 kD，包括ERK1、ERK2 2种亚型，二者互为同工异构体[11]。肝纤维化组织中肝细胞、肝窦血管内皮细胞、胆管上皮及HSC均可表达ERK1，以HSC表达最多，而且随肝纤维化进展而表达增高[11]。已有少量研究认为，ERK1、ERK2在细胞的增殖过程中具有不同的作用[12]，在神经元的氧化应激过程中，ERK1与ERK2可能具有互为拮抗的作用[13]。也有多项研究证实，ERK通路对细胞外基质的合成与降解具有调控作用，可能促进MMP的转录表达及活化[3-4，14-15]。本研究发现，HB-EGF(40 ng/mL)处理HSC-T6 48 h，能够有效刺激HSC-T6表达EGFR、ERK1，活化胞内Ras/ERK信号通路，同时也使MMP-2、TIMP-1的表达发生不同程度的改变。因此，笔者推测HB-EGF可能通过ERK信号通路进一步对MMP-2、TIMP-1表达产生影响，从而调控HSC对胶原的合成与降解。

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(编辑:张慧茹)

Effect of HB-EGF on the Activation of Ras/ERK Signal Pathway and the Expression of MMP-2, TIMP-1 in HSC-T6 cells

ZHANG Lijuan, HE Binbin, HUANG Yuehong, CHEN Zhixin, WANG Xiaozhong

Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo investigate the effect of HB-EGF on Ras/ERK signaling transduction pathway and MMPs, TIMPs of HSC.MethodsThe rat hepatic stellate cells T6(HSC-T6) were treated with DMEM supplemented with 2%FBS, HB-EGF(20,40,80 ng/mL) for 24 or 48 h.We used QRT-PCR to detect the expression of MMP-2 and TIMP-1’s mRNA in cells stimulated by HB-EGF at different concentrations and times.We analyzed EGFR gene at the level of transcription by QRT-PCR, and determined a best concentration and time of HB-EGF (40 ng/mL, 48 h) to stimulate the Ras/ERK signaling transduction pathway (ERK1, ERK2, P38MAPK) in HSC-T6 cells before detecting the activation of Ras/ERK pathway.ResultsMMP-2 mRNA and protein were increased in time-dependent pattern, while TIMP-1 was decreased; EGFR mRNA was increased when cells cultured with HB-EGF 48 h at concentration of 40 ng/mL, compared to the control group (P<0.05).Compared with control group, the expression of ERK1’s mRNA and protein were much higher after the treatment with 40 ng/mL HB-EGF 48 h; but no significant differences were found in the ERK2 and P38MAPK mRNA and protein.ConclusionHB-EGF has no appreciable effect on MMP-2 and TIMP-1 in HSC-T6; HB-EGF can promote EGFR and ERK1’s expression to activate the Ras/ERK signal transduction pathway in HSC-T6 cells.

epidermal growth factor； heparin； hepatocytes； astrocytes； rats； extracellular signal-regulated map kinases； ras proteins； intercellular signaling peptides and proteins； matrix metalloproteinases； tissue inhibitor of metalloproteinase-1

2015-10-12

福建省临床医学重点专科资助项目(闽卫科教[2012]149号)

福建医科大学 附属协和医院消化内科，福州350001

张莉娟(1973-)，女，主任医师，医学博士. Email:zhanglijuan8482@sina.com

R332； R341； R329.24； R345.9； R575； R977.3； R977.6

A

1672-4194(2016)02-0069-05