miR-497靶向Bcl-2调控肝癌细胞增殖及凋亡的研究

张猛　张全　谭雨莎

miR-497靶向Bcl-2调控肝癌细胞增殖及凋亡的研究

张猛张全谭雨莎

目的：探讨miR-497靶向Bcl-2对肝癌细胞增殖、凋亡的调控作用。方法：选取肝癌组织及相应远癌正常组织，分别采用逆转录PCR（reverse transcriptton PCR，RT-PCR）、Western blot检测组织中miR-497及Bcl-2蛋白表达；选取肝癌细胞系HepG2，分别转染miR-497 mimics及对照寡核苷酸，采用RT-PCR、Western blot检测组织中miR-497及Bcl-2蛋白表达，采用MTT法检测各组细胞增殖活性，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡，采用双荧光素酶报告基因检测细胞荧光酶活性。结果：1）与远癌正常组织相比，肝癌组织中miR-497表达明显降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达明显增高（P＜0.05）；2）与转染对照寡核苷酸相比，转染miR-497可使HepG2中miR-497表达增高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）；3）与转染对照寡核苷酸相比，共转染miR-497与Bcl-2-WT可使HepG2荧光素酶活性降低（P＜0.05）；4）转染miR-497后，HepG2增殖活性较转染对照寡核苷酸明显降低（P＜0.05），而转染miR-497+Bcl-2后，HepG2增殖活性较单纯转染miR-497明显提高（P＜0.05）；5）转染miR-497后，HepG2总凋亡比例较转染对照寡核苷酸明显增高（P＜0.05）；而转染miR-497+Bcl-2后，HepG2总凋亡比例较单纯转染miR-497明显降低（P＜0.05）。结论：miR-497可通过靶向Bcl-2抑制肝癌细胞增殖同时促进细胞凋亡。

miR-497Bcl-2肝癌细胞增殖细胞凋亡

肝癌是临床常见恶性肿瘤，致死率较高［1］。由于难以早期发现，故仅有少部分患者可行手术治疗［2-3］。放化疗是晚期肝癌常用的辅助治疗手段，但不良反应较大，且无法获得长期生存。因此，寻求更安全、高效的治疗方案是临床亟待解决的问题。微小RNA（miRNA）属于内源性非编码小分子RNA，其可通过5'-种子区与调控一个或多个靶基因mRNA的3'-非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）碱基互补配对，从而调控靶基因表达，进而起到类似抑癌或促癌基因的作用［4］。miR-497定位于人类17p13.1，是近年来研究较广泛的miRNA［5］。有研究证实，miR-497可能在肝癌进程中起到类似抑癌基因的作用，而靶向Bcl-w可能是其调控肝癌细胞增殖活性的主要机制［6］。但miR-497是否还可通过靶向其他下游靶基因参与肝癌的发生发展仍不明确。本研究通过检测miR-497及其下游潜在靶点Bcl-2在肝癌组织及肝癌细胞系HepG2中的表达，分析miR-497靶向Bcl-2对肝癌细胞增殖及凋亡的调控作用及分子机制，旨在为肝癌的临床治疗提供新思路。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂盒、反转录试剂盒（均购于美国ABI公司）；miR-497 mimics、对照寡核苷酸、Bcl-2 3'-UTR质粒（均购于美国Invitrogen公司）；MTT、链霉素、青霉素（均购于美国Sigma公司）；相关抗体（购于大连Santa Cruz公司）；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（购于上海碧云天生物技术有限公司）；miR-497、U6引物（由上海生工生物工程有限公司合成）；无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.1.2细胞及标本肝癌细胞系HepG2（购于美国ATCC细胞库）；选取河北大学附属医院50例肝癌组织及远癌正常组织，均为手术切除的新鲜样本，并经病理学检测证实为原发性肝细胞癌，所有患者术前均未接受过化疗。本研究获得患者知情同意且得到医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1细胞培养常规复苏HepG2，用DMEM培养液（10%胎牛血清+1%双抗）重悬浮细胞，并置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中培养，每天换液1次，收集对数生长期细胞，提取细胞总RNA及总蛋白待后续实验。

1.2.2细胞转染用DMEM培养液（10%胎牛血清+1%双抗）将上述对数生长期的HepG2细胞密度调节至2× 105cells/well，并接种于6孔板中，1 mL/孔，将细胞置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中培养24 h；将细胞随机分为对照寡核苷酸组、miR-497 mimics组及miR-497 mimics+Bcl-2组，利用LipofectamineTM2000分别转染miR-497 mimics（50 nmol/L）、对照寡核苷酸（50 nmol/L）及Bcl-2表达质粒（50 nmol/L）；转染后将细胞置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养48 h；常规收集细胞总RNA及总蛋白待后续实验。

1.2.3双荧光素酶报告基因检测分别构建含有野生型Bcl-2 3'-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒（Bcl-2-WT）和含有突变型Bcl-2 3'-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒（Bcl-2-Mut）。收集对数生长期的HepG2，调节细胞密度至2×105cells/well，并接种于24孔板中，将Bcl-2-WT质粒、Bcl-2-Mut质粒与miR-497 mimics或对照寡核苷酸共转染至HepG2，每组设3个复孔，将细胞置于置于恒温培养箱（37℃、5% CO2）中继续培养48 h；以海肾质粒荧光值作为内参，检测各组细胞荧光素酶活性。

1.2.4MTT法检测细胞增殖转染结束后将细胞置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养4 h，培养结束后，800 r/min离心10 min，弃上清每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，继续置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）培养4 h，后吸弃孔内培养上清液，加入DMSO （100 μL/孔），振荡10 min，使结晶物充分溶解，采用全自动酶标仪测测OD490nm吸光值。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡转染结束后将细胞置于恒温培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养48 h，采用凋亡试剂盒（Annexin-V/PI）进行避光染色，1 h后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞总凋亡=早期凋亡细胞（Annexin-V+/PI-）+晚期凋亡细胞（Annexin-V+/PI+）。

1.2.6实时定量荧光（Real-time PCR）检测miR-497表达收集HepG2、肝癌组织标本及远癌正常组织样本，参照Trizol试剂盒说明书提取细胞或组织中的总RNA，利用反转录试剂盒逆转录总RNA至cDNA，取逆转录产物加入SYBR Green法行RT-PCR，以U6为内参，引物序列见表1。

表1　引物序列Table 1　Primer sequence

1.2.7Western blot法检测Bcl-2蛋白表达常规提取细胞/组织蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测样品蛋白浓度，取适量样品行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4 h，后依次加入一抗（1:2 000）、二抗（1:500）孵育，按ECL试剂盒说明书行电化学发光检测。

1.3统计学分析

2　结果

2.1肝癌组织及远癌正常组织中miR-497、Bcl-2表达及相关性分析

RT-PCR检测结果显示，肝癌组织中miR-497表达显著低于远癌正常组织（P＜0.05，图1）。Western blot检测结果显示，肝癌组织中Bcl-2蛋白表达显著高于远癌正常组织（P＜0.05，图2）。Pearson相关性分析结果显示，肝癌组织中miR-497与Bcl-2蛋白表达呈负相关（r=-0.315，P=0.018）。

图1　肝癌组织及远癌正常组织中miR-497表达Figure 1　Expression of miR-497 in liver carcinoma tissue and para-carcinoma tissue

图2　肝癌组织及远癌正常组织中Bcl-2蛋白表达Figure 2　Protein expression of Bcl-2 in liver carcinoma tissue and paracarcinoma tissue

2.2转染miR-497 mimics对HepG2中miR-497、Bcl-2表达的影响

逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测结果显示，与转染对照寡核苷酸相比较，转染miR-497 mimics可使HepG2中miR-497表达增高（P＜0.05，图3）。Western blot检测结果显示，与转染对照寡核苷酸相比较，转染miR-497 mimics可使HepG2中Bcl-2表达降低（P＜0.05，图4）。

图3　转染miR-497mimics对HepG2中miR-497表达的影响Figure 3　Expression of miR-497 in HepG2 after transfection with miR-497 mimics

图4　转染miR-497mimics对HepG2中Bcl-2蛋白表达的影响Figure 4　Protein expression of Bcl-2 in HepG2 after transfection with miR-497 mimics

2.3miR-497对Bcl-2 3'-UTR的靶向作用

双荧光素酶活性实验结果显示，共转染miR-497 mimics与Bcl-2 3'-UTR野生质粒后，HepG2荧光素酶活性较转染control miRNA组显著降低（P＜0.05）；共转染miR-497mimics与Bcl-2 3'-UTR突变质粒后，HepG2荧光素酶活性无显著性差异（P＞0.05）（图5）。

图5　HepG2中miR-497与Bcl-2 3'-UTR结合情况Figure 5　Combination condition of miR-497 and Bcl-2 3′-UTR in HepG2

2.4转染miR-497 mimics、Bcl-2对HepG2增殖活性的影响

MTT法检测结果显示，转染miR-497 mimics后24、48、72 h后HepG2增殖活性较转染对照寡核苷酸显著降低（P＜0.05）；而共转染miR-497 mimics、Bcl-2后，HepG2增殖活性较单纯转染miR-497 mimics显著提高（P＜0.05），但仍显著低于转染对照寡核苷酸组（P＜0.05）（图6）。

2.5转染miR-497 mimics、Bcl-2对HepG2凋亡的影响

转染miR-497 mimics后HepG2早期凋亡细胞比例、晚期凋亡细胞比较及总凋亡细胞比例均显著高于转染对照寡核苷酸（P＜0.05）。而共转染miR-497 mimics+Bcl-2后，HepG2早期凋亡细胞比例、晚期凋亡细胞比较及总凋亡细胞比例较单纯转染miR-497 mimics均显著降低（P＜0.05），但仍显著高于转染对照寡核苷酸组（P＜0.05）（表2）。

图6　转染miR-497、Bcl-2对HepG2增殖活性的影响Figure 6　Effect of transfection miR-497 and Bcl-2 on the proliferation of HepG2

表2　转染miR-497、Bcl-2对细胞凋亡的影响 （%）Table 2　Effect of transfection miR-497 and Bcl-2 on cell apoptosis（%）

3　讨论

miRNA属于高度保守的非编码小分子单链RNA，并广泛存在于真核生物中。正常生理状态下，机体内miRNA表达遵守严格的组织、时序特异性；但在肿瘤环境下，不同miRNA则表现出不同的生物学活性，并起到类似癌基因或抑癌基因的作用［7］。miR-497在多种恶性肿瘤中均表达缺失或下调，如结肠癌［8］、胃癌［9］、宫颈癌［10］、骨肉瘤［11］及脑胶质瘤［12］等，而过表达miR-497则可使上述恶性肿瘤细胞增殖能力得到抑制，提示miR-497在恶性肿瘤发生与发展过程中发挥着抑癌基因的功能。本研究结果显示，肝癌组织中miR-497表达显著低于远癌正常组织（P＜0.05），与丁文周等［13］研究结果一致；而转染miR-497 mimics可使肝癌细胞HepG2中miR-497表达上调，同时明显抑制肝癌细胞HepG2增殖活性，提示miR-497在肝癌中同样起着类似抑癌基因的作用。

原癌基因Bcl-2定位于18q21，长约230 kb，含2个内含子和3个外显子，主要存在于细胞核膜、线粒体及内质网膜中。Bcl-2可通过调节胞内Ca2+浓度、与bax结合形成异构二聚体、活化R-ras信号通路等多种途径发挥抑凋亡作用，从而参与恶性肿瘤细胞的生长与演变。研究证实，Bcl-2在宫颈癌［14］、乳腺癌［15］等恶性肿瘤组织中高表达，且其高表达水平与肿瘤分化程度、淋巴转移及临床预后密切相关。本研究结果显示，肝癌组织中Bcl-2蛋白表达显著高于远癌正常组织（P＜0.05）；转染miR-497 mimics可使HepG2中Bcl-2蛋白表达降低，Pearson相关性分析结果进一步提示HepG2中miR-497表达与Bcl-2表达呈负相关（P＜0.05），而这种相关性很可能是由miR-497负向调控Bcl-2表达所致。双荧光素酶活性检测显示，miR-497可与Bcl-2 3'-UTR特异性结合，从而降低细胞荧光酶活性，进一步印证上述研究提出的miR-497靶向Bcl-2的观点。

细胞增殖活性检测及凋亡测定结果显示，转染miR-497可使HepG2增殖活性降低、细胞凋亡比例增加，而共转染miR-497及Bcl-2则可实现miR-497对HepG2增殖抑制作用及凋亡促进作用的部分逆转，提示miR-497可通过靶向Bcl-2调控HepG2增殖及凋亡。但值得注意的是，转染Bcl-2无法完全逆转miR-497对HepG2增殖及凋亡的调控作用。其原因可能与miR-497靶向基因众多有关，目前已知的miR-497下游靶基因包括CCNEl、Bcl-w等，由于miR-497可能通过同时靶向多个下游靶基因发挥作用，故仅研究其Bcl-2靶向作用并无法完全阐述其对肝癌细胞增殖、凋亡的调控机制。

综上所述，miR-497与Bcl-2存在靶向关系，miR-497可通过靶向调控Bcl-2表达抑制肝癌细胞增殖，同时促进其凋亡。此外，miR-497还可能通过靶向其他下游基因参与肝癌的发生与演变过程。

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（2016-04-05收稿）

（2016-08-11修回）

（编辑：武斌校对：杨红欣）

张猛专业方向为肝胆胰脾疾病的治疗。

E-mail：soulsinger@126.com

miR-497 regulates cell proliferation and apoptosis by targeting Bcl-2 in liver cancer cells

Meng ZHANG，Quan ZHANG，Yusha TAN

Correspondence to:Quan ZHANG；E-mail:soulsinger@126.com

Department of Hepatobiliary Surgery of Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China

Objective:To evaluate the effect of miR-497 on regulating cell proliferation and apoptosis by targeting Bcl-2 in liver cancer cells. Methods:We tested liver cancer tissue and para-carcinoma tissue and used RT-PCR or Western blot to detect the expression of miR-497and Bcl-2 protein.We also tested the liver cancer cell HepG2 transfected with miR-497 mimics and mimic control.The expressions of miR-497and Bcl-2 protein were detected by RT-PCR or Western blot.Cell proliferation activity was detected by the MTT method，cell apoptosis was detected by flow cytometry，and cell luciferase activity was detected by the dual-luciferase reporter gene experiment.Results:1）Compared with para-carcinoma tissue，the miR-497 expression of liver cancer tissue significantly decreased（P＜0.05），whereas the Bcl-2 protein expression of liver cancer tissue significantly increased（P＜0.05）.2）Compared with transfection mimic control，transfection miR-497 mimics couldincreasethemiR-497expressionof liver cancer cell HepG2（P＜0.05）anddecreasetheBcl-2proteinexpressionof liver cancer cell HepG2 （P＜0.05）.3）Compared with transfection mimic control，co-transfection with miR-497 mimics and Bcl-2-WT could significantly decrease the luciferase activity of liver cancer cell HepG2（P＜0.05）.4）Compared with transfection mimic control，the proliferative activity of liver cancer cell HepG2 significantly decreased after transfection with miR-497 mimics（P＜0.05）.Compared with transfection miR-497 mimics，the proliferative activity of liver cancer cell HepG2 significantly increased after transfection with miR-497 mimics+Bcl-2（P＜0.05）.5）Compared with transfection mimic control，the total apoptosis rate of liver cancer cell HepG2 significantly increased after transfection with miR-497 mimics（P＜0.05）.Compared with transfection miR-497 mimics，the total apoptosis rate of liver cancer cell HepG2 significantly decreased after transfection with miR-497 mimics+Bcl-2（P＜0.05）.Conclusion:In liver cancer cells，miR-497 could target Bcl-2 to inhibit cell proliferation and enhance cell apoptosis.

miR-497，Bcl-2，liver cancer，cell proliferation，cell apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.16.381

河北大学附属医院肝胆外科（河北省保定市071000）

张全soulsinger@126.com