猴D型逆转录病毒p27基因的克隆表达及诊断价值评价

周 洁， 杨燕飞，2， 胡建华， 陶凌云， 高 诚（2.上海实验动物研究中心， 上海20203； 2.扬州大学兽医学院， 扬州225009）

猴D型逆转录病毒p27基因的克隆表达及诊断价值评价

周 洁1， 杨燕飞1，2， 胡建华1， 陶凌云1， 高 诚1
（2.上海实验动物研究中心， 上海201203； 2.扬州大学兽医学院， 扬州225009）

目的 克隆表达猴D型逆转录病毒（SRV） p27基因，评价其诊断价值。方法 PCR扩增p27基因片段，定向克隆至原核表达载体pET-28b（+），重组质粒转化大肠杆菌Rosetta （DE3）中诱导表达，利用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定，目的蛋白经镍柱亲和层析纯化后用ELISA方法评价其诊断价值。结果 重组质粒转化宿主菌后在37 ℃，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导4 h，可溶性p27蛋白表达量最大，且具有免疫学活性。纯化后测定融合蛋白浓度为2.043 g/L，纯度93.3%，以融合蛋白为诊断抗原包被ELISA板检测3份标准阳性血清和22份阴性血清，检出率为100% 。结论 p27 基因成功表达并具有良好的反应原性，可作为猴D型逆转录病毒血清学检测的候选抗原。

猴D型逆转录病毒； p27基因； 原核表达； 血清学检测

猴D型逆转录病毒（simian type-D retrovirus，SRV）， 属逆转录病毒科肿瘤病毒亚科的D型病毒， 是猴获得性免疫缺陷综合征（simian acquired immunodeficiency syndrome， SAIDS）即猴艾滋病的主要病原体之一［1］。SRV的自然宿主是猕猴， 主要通过猴间互相撕咬使唾液中的病毒进入血液而传播， 也可通过性传播和胎盘传播。感染后的临床表现和病理特征与人艾滋病类似， 如顽固性腹泻、贫血、体质量减轻、脾肿大、淋巴结病、慢性感染并对治疗不产生疗效反应、坏死性口炎、表皮和腹膜后纤维瘤等。SRV在其天然宿主亚洲猴群中流行率较高， 有的猴群可达100%，1970年代末和1980年代初， 美国几个灵长类研究中心爆发SRV导致了大批实验用猴死亡， 近年来还有SRV感染人的报道［2-6］。

由于猴在形态学、生殖生理特性和生化代谢等方面与人类非常类似，其遗传物质和人类有很高的同源性，因此猴被作为人类最理想的替身和重要的研究、实验对象，广泛应用于医学、药学、毒理学等领域的科学研究，特别是在新药临床前安全性评价中猴是不可替代的实验动物。其质量不仅直接影响科学研究的进程和结果，而且也直接影响从事实验动物科研、生产等相关人员的生命健康和安全以及社会公共卫生体系的安全［7］。因此需要定期对猴群进行SRV感染的监测以剔除传染源，必要时使用疫苗。我国国标GB/T 14926.61-2001［8］规定SRV是SPF级猴的必检项目，推荐方法为酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光试验（IFA）。目前除了美国BioReliance和VRL等少数几个实验室拥有实验猴SRV的ELlSA试剂盒之外，市场上还没有同类产品出售。国外试剂盒价格昂贵且货期不稳定，因此建立一种快速、准确的SRV检测方法有助于国内开展实验猴SRV的检测工作。本研究对SRV的高度保守序列p27基因进行了克隆表达，并对其诊断价值进行了评价，为进一步开展SRV的快读诊断方法奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株及载体 SRV-2株细胞培养物、pET-28b（+）载体质粒均由本实验室保存； pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司生物公司； 感受肽细胞E.coli Rosetta （DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 主要试剂 QIAamp Viral RNA Mini Kit购自Qiagen公司（德国）； PrimeSTAR Max DNA Polymerase聚合酶、AMV逆转录酶、dNTPS、T4连接酶、限制性核酸内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司生物公司； 辣根过氧化物酶（HRP）酶标山羊抗猴IgG购自上海优宁维生物科技有限公司； 琼脂糖凝胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司； Ni-IDA-SefinoseTMResin试剂盒购自生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根据GenBank发表的SRV-2株基因序列（16605.1）， 针对p27基因（nt1385～nt2062）设计一对特异性引物， 用于扩增p27基因。

上游引物： 5'-AGCCATATGATTTTCCCAGTAACG-3'，引入NdeⅠ酶切位点；

下游引物：5'-TGATCTCGAGGTCTGTCCACTAAAG-3'， 引入XhoⅠ酶切位点；

SRV细胞培养物病毒总RNA的提取按照QIAamp Viral RNA Mini 试剂盒说明书操作； 反转录过程参照AMV逆转录酶操作说明书； 取上述3 μL cDNA产物作为PCR模板，PCR反应条件为： 通过RT-PCR方法扩增p27 基因， 扩增条件为： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 22 s，58 ℃ 20 s， 72 ℃ 45 s， 30个循环； 72 ℃5 min。回收PCR产物与pMD18-T 载体连接，转化感受态E.coli DH5α细胞，提取质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD-P27。

1.2.2 重组质粒的构建 pMD-P27经Xho I/ Nde I双酶切后与进行同样处理的pET-28b（+）载体相连，接连接产物转化感受态E.coli Rosetta（DE3）细胞，鉴定后获得的阳性质粒命名为pET-P27。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达 pET- P27转化感受态E.coli Rosetta （DE3），挑取单菌落于含30 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的LB培养基中，37 ℃，220 r/min摇床培养至A600值0.6左右时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG， 220 r/min，37 ℃诱导4 h，未加IPTG诱导剂的阳性菌液作为阴性对照。离心收集菌体细胞， 用缓冲液（20 mmol/L PB， 300 mmol/L NaCl，质量分数0.1%TritonX-100，pH8.0）重悬，冰浴中超声破碎菌体，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵体溶解液（8 m/L 尿素， 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）溶解，分别用于SDS-PAGE分析表达产物。

1.2.4 重组蛋白的纯化 大量诱导表达后离心收集菌体超声处理后，上清用Ni-IDA-SefinoseTMResin试剂盒纯化， 具体步骤如下： 取5 mLNi-IDA， 用10倍柱床体积的结合缓冲液（binding buffer）清洗平衡柱子，流速5 mL/min； 上柱，流速为2 mL/min，收集穿透液； 10倍柱床体积的结合缓冲液清洗柱子，流速5 mL/min； 漂洗缓冲液（wash buffer）洗去杂质，流速2 mL/min，收集洗脱液； 洗脱缓冲液（elution buffer）洗脱，流速2 mL/min，收集洗脱液。将收集到的各组分进行SDS-PAGE检测后，将纯度最好的组分透析至1×PBS，pH8.0中，0.45 μm滤膜过滤浓缩分装，测定蛋白的浓度（具体操作按照生工的SK3071非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒进行）及纯度，-80℃分装保存。

1.2.5 重组蛋白的Western blot鉴定 纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上， 加封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）温室摇床封闭1 h； 先后以50倍稀释的SRV标准阳性血清4 ℃孵育过夜，2 000倍稀释的羊抗猴IgG-HRP温室摇床孵育1 h，TMB显色。

1.2.6 重组蛋白的诊断价值评价 以纯化的重组蛋白作为诊断抗原包被ELISA板（浓度为3.063 mg/孔）4℃包被过夜； 封闭缓冲液（blocking buffer）于37 ℃封闭2.5 h； 标准阴、阳性血清1∶100稀释， 作用60 min； 酶标二抗1：10 000稀释，底物显色15 min，2 mol/L H2SO4终止反应； 酶标仪测量A630值， 以阴性血清的平均A630值乘以2.1作为阳性判定标准。

2 结果

2.1 目的基因克隆及表达载体的构建

经RT-PCR扩增获得大小约为750 bp 的特异性片断（图1），与预期大小相符，连接pMD18-T 载体测序，结果证实扩增片断723 bp， 包含有SRV-2 p27完整ORF共678 bp，编码226 aa。将pMD-P27双酶切后与同样处理的pET-28b（+）载体连接，获得阳性质粒pET- P27。设计一对特异性引物，用于扩增p27基因。

上游引物： 5'-AGCCATATGATTTTCCCAGTAACG-3'，引入NdeⅠ酶切位点；

下游引物： 5'-TGATCTCGAGGTCTGTCCACTAAAG-3'， 引入XhoⅠ酶切位点；

SRV细胞培养物病毒总RNA的提取按照QIAamp Viral RNA Mini 试剂盒说明书操作； 反转录过程参照AMV逆转录酶操作说明书； 取上述3 μL cDNA产物作为PCR模板，PCR反应条件为： 通过RT-PCR方法扩增p27 基因， 扩增条件为： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 22 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃ 5 min。回收PCR产物与pMD18-T 载体连接，转化感受态E.coli DH5α细胞，提取质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将鉴定为阳性的重组质粒命名为pMD-P27。

1.2.2 重组质粒的构建 pMD-P27经Xho I/ Nde I双酶切后与进行同样处理的pET-28b（+）载体相连，接连接产物转化感受态E.coli Rosetta （DE3）细胞，鉴定后获得的阳性质粒命名为pET-P27。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达 pET- P27转化感受态E.coli Rosetta （DE3），挑取单菌落于含30 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的LB培养基中，37 ℃，220 r/min摇床培养至A600值0.6左右时添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min， 37 ℃诱导4 h，未加IPTG诱导剂的阳性菌液作为阴性对照。离心收集菌体细胞， 用缓冲液（20 mmol/L PB， 300 mmol/L NaCl，质量分数0.1%TritonX-100，pH8.0）重悬，冰浴中超声破碎菌体， 分别离心收集上清和沉淀， 沉淀用500 μL包涵体溶解液（8 m/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）溶解，分别用于SDS-PAGE分析表达产物。

1.2.4 重组蛋白的纯化 大量诱导表达后离心收集菌体超声处理后， 上清用Ni-IDA-SefinoseTMResin 试剂盒纯化， 具体步骤如下： 取5 mL Ni-IDA， 用10倍柱床体积的结合缓冲液清洗平衡柱子， 流速5 mL/min；上柱，流速为2 mL/min，收集穿透液； 10倍柱床体积的结合缓冲液清洗柱子，流速5 mL/min； 漂洗缓冲液洗去杂质，流速2 mL/min， 收集洗脱液； 洗脱缓冲液洗脱，流速2 mL/min，收集洗脱液。将收集到的各组分进行SDS-PAGE检测后，将纯度最好的组分透析至1×PBS，pH8.0中，0.45 μm滤膜过滤浓缩分装，测定蛋白的浓度（具体操作按照生工的SK3071非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒进行）及纯度，-80℃分装保存。

1.2.5 重组蛋白的Western blot鉴定 纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，加封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST）温室摇床封闭1 h； 先后以50倍稀释的SRV标准阳性血清4 ℃孵育过夜， 2 000倍稀释的羊抗猴IgG-HRP温室摇床孵育1 h， TMB显色。

1.2.6 重组蛋白的诊断价值评价 以纯化的重组蛋白作为诊断抗原包被ELISA板（浓度为3.063 mg/孔）4℃包被过夜； 封闭缓冲液（blocking buffer）于37 ℃封闭2.5 h； 标准阴、阳性血清1∶100稀释， 作用60 min； 酶标二抗1∶10 000稀释，底物显色15 min，2 mol/L H2SO4终止反应； 酶标仪测量A630值，以阴性血清的平均A630值乘以2.1作为阳性判定标准。

2 结果

2.1 目的基因克隆及表达载体的构建

经RT-PCR扩增获得大小约为750 bp 的特异性片断（图1），与预期大小相符，连接pMD18-T载体测序， 结果证实扩增片断723 bp， 包含有SRV-2 p27完整ORF共678 bp，编码226 aa。将pMD-P27双酶切后与同样处理的pET-28b（+）载体连接，获得阳性质粒pET- P27。

2.2 重组蛋白的表达及活性鉴定

图1 RT-PCR扩增p27基因产物M： DNA molecular weight standards； 1： Water control；2： RT-PCR products Figure 1 RT-PCR products of p27 gene

重组质粒转化E.coli Rosetta （DE3）， 37℃， IPTG浓度0.5 mmol/L诱导4 h表达量最大， 表达产物的SDS-PAGE分析结果表明，重组蛋白以上清形式表达，蛋白分子量约29000， 与预期相符（图2）， Western blot 结果表明重组蛋白具有良好的特异性和反应原性（图3）。

2.3 重组蛋白纯化

表达菌大量诱导表达后收集裂解上清， 经Ni-IDA过柱纯化后蛋白大小与纯化前一致（图4），按照SK3071 非干扰型蛋白浓度测定试剂盒说明书，以不同体积蛋白的480 nm吸收值的平均值作为纵坐标，对应的BSA蛋白质浓度为横坐标，绘制BSA标准曲线图，按照480 nm吸光度与蛋白质量的线性关系为y=-0.0043x+1.1157，求得目的蛋白浓度为2.043 mg/mL，薄层扫描确定其纯度为93.3%。蛋白测定结果见表1，图5。

图2 SDS-PAGE检测重组p27蛋白在Rosetta中的表达Figure 2 Expression of recombinant p27 protein in E.coli Rosetta analyzed by SDS-PAGE

图3 重组p27蛋白Western-blot 分析结果Figure 3 Western blot analysis of recombinant p27 protein

表1 各体积蛋白的480 nm吸收值及对应BSA蛋白浓度测定Table1 480nm absorption value of each volume protein and its corresponding BSA protein concentration

2.4 重组p27蛋白的诊断价值评价

以纯化的重组蛋白作为诊断抗原包被ELISA板，对3份标准阳性血清和22份阴性血清进行检测，3份阳性血清的A630值在0.355～1.210，22份阴性血清A630值在0.072～0.228，平均值为0.133，按照阴性平均A值的2.1 倍计算，阳性判定阈值为0.278。3份阳性血清检出率及22份阴性血清检出率为100%。

图5 BSA标准曲线图Figure 5 BSA standard curve

D型逆转录病毒分为内源性病毒（SERV）和外源性病毒（SRV）。SRV是引起SAIDS的主要病原。目前发现的SRV有7个血清型，其中，SRV-1～3已测序完成［9］。SRV的基因组结构与其他逆转录病毒相似， 两端为长末端重复序列（LTR）， 其在病毒DNA的合成、整合和病毒基因的表达等方面起调节作用。中间包含4个开放阅读框架（ORF）， 从5'端至3'端依次为： （1）编码核心蛋白的gag基因， 它编码一个大的前体核心蛋白，在病毒成熟过程中， 被蛋白酶水解成6个核心蛋白： p10、pp24、pp18、p12、p27、p14、p4； （2）编码蛋白酶（Protease）的prt基因；（3）编码逆转录酶（RT）和整合酶（核酸内切酶）的pol基因； （4）编码囊膜蛋白（包括外膜蛋白gp70、跨膜蛋白gp20）的env基因。在env基因之后还有一个意义不明的延伸到右侧LTR的短ORF［10，11］。

表2 重组蛋白对标准血清的ELISA检测结果Table2 Result of ELISA with recombinant protein to test standard sera

SRV不同血清型之间有交叉反应， 主要发生在衣壳蛋白p27和跨膜蛋白gp20～gp22区域， 在D型逆转录病毒基因组中它们是高度保守的一段序列［12］。本研究选取编码p27蛋白的基因作为研究对象，将其完整ORF插入原核表达载体pET-28b（+）的多克隆位点区，在37 ℃，IPTG浓度0.5 mmol/L 的条件下诱导4 h， 蛋白获得较高水平的表达， 且以上清形式存在。目的蛋白大小约29 000 （含His标签），与预期大小一致，Western blot 证实重组蛋白与猴SRV标准阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。基于融合蛋白所带的6个组氨酸标签，利用Ni-IDA柱对重组蛋白进行了纯化， 并获得了较高纯度的蛋白。将纯化的重组蛋白作为包被抗原， 通过间接ELISA方法严证重组蛋白的诊断价值。结果显示，3份阳性血清的A630值在0.355～1.210， 22份阴性血清A630值在0.072～0.228， 平均值为0.133， 按照阴性平均A值的2.1 倍计算，阳性判定阈值为0.278。3份阳性血清检出率及22份阴性血清检出率为与VRL的SRV试剂盒完全相符。本结果显示，重组蛋白具有血清学诊断价值，为下一步建立诊断方法奠定了基础。

［1］ Gardner MB， Marx PA.Simian acquired immunodeficiency syndrome［J］.Adv Virol Oncol， 1985（5）：57-81.

［2］ Hampton AL， Colby LA， Bergin IL Facial paralysis and lymphocytic facial neuritis in a rhesus macaque（Macaca mulatta）positive for simian retrovirus type D2.［J］.Comp Med， 2011， 61（6）：538-545.

［3］ 王芸， 吕龙宝， 马玉华， 等.猴D型逆转录病毒的研究进展［J］.上海畜牧兽医通讯， 2012， 6：14-15.

［4］ 陈志斌， 贲昆龙.猴D型逆转录病毒和猴艾滋病［J］.动物学研究， 1992， 13（2）：193-199.

［5］ Lerche NW， Marx PA， Osborn KG， et a1.Natura1 history of endemic type D retrovirus infection and acquired immune deficiency syndrome in group-housed rhesus monkeys［J］.Natl Cancer Inst， 1987， 79（4）：847-854.

［6］ Montiel NA.An updated review of simian beta retrovirus （SRV） in macaque hosts ［J］.J Med Primatol， 2010， 39（5）：303-314.

［7］ 张高红， 李明华， 郑永唐.AIDS猕猴模型在HIV疫苗研究中的应用［J］.动物学研究， 2007， 28（5）：556-562.

［8］ GB/T 14926.61-2001.猴逆转D型病毒检测方法［S］.

［9］ Nandi JS， Tikute SA， Chhangani AK， et a1.Natural infection by simian retrovirus-6（SRV-6） in Hanuman langurs （Semnopithecus entellus） from two different geographical regions of India［J］.Virology， 2003， 3l1（1）：192-201.

［10］ Hara M， Sata T， Kikuchi T， et al.Isolation and characterizationof a new simian retrovirus type D subtype from monkeys at the Tsukuba Primate Center， Japan［J］.Microbes Infect， 2005，7（1）：126-131.

［11］ Van der Kuyl AC， Mang R， Dekker JT， et al.Complete nucleotide sequence of simian endogenous type D retrovirus with intact genome organization： evidence for ancestry to simian retrovirus and baboon endogenous virus［J］.J Virol，1997， 71（5）：3666-3676.

［12］ Sonigo P， Barker C， Hunter E， et al.Nucleotide sequence of Mason-Pfizer monkey virus： an immune-suppressive D-type retrovirus［J］.Cell， 1986， 45（3）：375-385.

Production of Recombinant Simian Type-D Retrovirus p27 Gene and Evaluation of its Diagnostic Potential

ZHOU Jie1， YANG Yan-fei1，2， HU Jian-hua1， TAO Ling-yun1， GAO Cheng1
（1.Shanghai Research Center of Laboratory Animal， Shanghai 201203；
2.Yangzhou University College of Veterinary， Yangzhou 225009）

Objective To Clone and express p27 gene of simian type-D retrovirus and evaluate its diagnostic potential.Method The p27 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the prokaryotic expressive vector pET-28b（+） after sequencing.Recombinant plasmid was transformed into E.coli Rosetta DE3） and recombinant protein was analysed by SDS-PAGE and Western blot.The protein was purified affinity chromatography with Ni-NTA， and its diagnostic value was evaluated by ELISA.Results The highest soluble expression level of recombinant protein was obtained after being induced at 37℃ for 4 h，with the concentration of Isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） was 0.5 mmol/L， and the recombinant protein had immunological activity.After purified， the concentration of protein was 2.043 g/L， and the purity was 93.3%.The indirect ELISA was developed using the purified recombinant protein，detection of 3 standard positive sera and 22 negative sera showed the detection rate were 100%.Conclusion Recombinant p27 protein from prokaryotic expression system had perfect antigenicity，which would can be used as the candidate antigen of simian type-D retrovirus.

Simian type-D retrovirus； p27 gene； Prokaryotic expression； Serological detection

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0270-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.005

上海市科委科技创新行动计划（13140900600）， 上海市科委研发平台专项（15DZ2292400）

周 洁（1978-）， 女， 博士， 副研究员， 主要从事动物病毒分子生物学及免疫学方面的研究。E-mail： zhoujie0526@163.com

高 诚（1961-）， 男， 研究员。E-mail： gaochengdgb@126.com