改良组织块法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞

陈 芳， 陈利峰， 刘 琴， 王丽平， 张 宜（解放军广州军区武汉总医院.医学实验科， .中西医结合科， 武汉430070）

改良组织块法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞

陈 芳1， 陈利峰2， 刘 琴1， 王丽平1， 张 宜1
（解放军广州军区武汉总医院1.医学实验科， 2.中西医结合科， 武汉430070）

目的 通过改良组织块细胞培养法，建立一种简单、可行的佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞（FLS）体外培养方法并观察细胞生物学特性。方法 通过注射弗氏完全佐剂建立关节炎模型，无菌条件下取佐剂性关节炎兔膝关节滑膜组织，剔净后剪成碎块，用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分，碎片接种于培养皿，观察细胞生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞，用噻唑蓝（MTT）法绘制其生长曲线，并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况。结果 体外培养的佐剂性关节炎兔FLS形态为长梭形纤维样，符合FLS的生长特征，免疫荧光检测显强表达波形蛋白。结论 改良组织块法可以分离培养出兔佐剂性关节炎成纤样维滑膜细胞，方法简便，成功率高，满足实验要求。

关节炎； 兔； 成纤维样滑膜细胞（FLS）； 改良组织块法

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身性免疫性疾病，其病因和发病机制尚未完全明确，在治疗方面亦无特效治疗措施［1］。寻找安全、有效缓解RA病情的药物是目前治疗RA的重点［2］。佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）动物模型已经广泛用于类风湿关节炎发病机制的研究和评估潜在的抗类风湿关节炎药物的临床应用［3］。滑膜表面有2～4层扁平或立方形的上皮样结缔组织细胞，即为滑膜细胞，成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）为滑膜中最主要的细胞，它参与滑膜增生和组织蛋白酶的分泌， 与RA晚期关节损伤有着密切的关系［4，5］。本研究通过改良组织块法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞， 为RA在细胞和分子水平的深入研究以及药物的筛选提供大量的细胞。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级新西兰白兔16只，雌雄不限，体质量2.5～3.0 kg，由武汉市新洲区万千佳禾实验动物养殖场提供［SCXK（鄂）2011-0011］。本实验在广州军区武汉总医院医学实验科动物实验设施内进行［SYXK（鄂）2014-0082］，饲养间温度18～24 ℃，相对湿度40%～60%，单笼饲养。

1.2 材料

DMEM-H培养基、PBS均购自美国Hyclone公司； 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司； TritonX-100、4，6二脒基吲哚（DAPI）、青链霉素双抗、胰蛋白酶均购自碧云天公司； MTT和DMSO均购自美国Amersco公司； 小鼠Vimentin抗体、荧光（Cy3）标记羊抗小鼠IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司； 弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司；倒置显微镜、DP70荧光显微镜均为日本奥林巴斯公司生产； 生物安全柜为海尔公司生产； CO2细胞培养箱为日本Sanyo公司生产； 细胞计数器为香港基因生物医学科技有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 AA兔模型的建立［6］新西兰白兔16只适应性喂养1周后，随机分组为正常组和模型组。称体质量后兔足爪剃毛，测足趾部周径。模型组初次诱导： 将家兔背部肩胛骨间及双膝关节以下的毛用脱毛剂脱去，每只兔右跖部皮下注射弗氏完全佐剂0.4 mL，同时注射背部4点，每点0.2 mL。加强诱导： 注射后7 d加强注射弗氏完全佐剂1次，右跖部皮下0.4 mL， 背部任意2点，每点注射0.2 mL。造模24 d后观察足趾部肿胀情况和足关节的病变特征，鉴定模型。

1.3.2 AA兔成纤维样滑膜细胞的分离培养 取AA模型兔一只，耳缘静脉注射空气处死。体积分数75%酒精浸湿膝关节，去被毛，体积分数1%碘伏与75%酒精依次消毒，解剖找出关节囊，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，取出平滑光亮的滑膜层组织，将滑膜组织放入含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的PBS中。移入超净台中，用上述PBS洗3次，灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分， 剪成1～5 mm3大小， 置入3.5 cm平皿中，每皿7～8块滑膜组织块，温箱内放置5 min后，加入1 mL含100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素、体积分数10%胎牛血清的DMEM-H培养液， 37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后每皿轻轻补加1 mL上述培养液，倒置显微镜下观察细胞的生长形态并照相。4～5 d后进行首次换液，15～20 d后细胞达到90%融合，用含质量分数0.25%EDTA的胰酶进行1∶2传代。

1.3.3 噻唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线 取第3代细胞，按1×103/孔接种到96孔培养板内，每组设置5个复孔，置37 ℃、5%CO2培养箱培养，分别于培养1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d随机取出一组，每孔加入5 mg/mL MTT 25 μL，继续孵育4 h形成甲赞结晶，小心吸弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）125 μL/孔，微量震荡器震荡5 min后，在酶联免疫检测仪上于490 nm波长处测定吸光度（A值），绘制细胞生长曲线。

1.3.4 AA兔成纤维样滑膜细胞鉴定 取第3代细胞，按每孔1×105接种含有爬片的6孔板中，细胞培养48 h后，吸出培养液，用PBS洗2遍，加入质量分数4%多聚甲醛固定液于4 ℃固定30 min。 PBS洗3次，0.5%Triton X-100室温通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30 min。吸水纸吸掉封闭液，不洗，滴加足够量的Vimentin一抗（1∶100稀释）并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。PBS 洗3次，吸水纸吸干爬片上多余液体，滴加稀释好的荧光（Cy3）标记羊抗小鼠IgG（1∶100稀释），湿盒中20～37 ℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

2 结果

2.1 AA兔模型的鉴定

造模24 d后观察，足关节及足趾部明显肿胀（图1A）； 解剖可见模型兔足趾部有明显微血管增生和炎症（图1B）； 滑膜组织切片HE染色显示， 正常组的滑膜细胞呈现串珠样规则排列（图1C）， 而模型组的滑膜细胞排列紊乱（图1D）， 提示AA兔模型制备成功。

2.2 AA兔成纤维样滑膜细胞形态观察

改良组织块贴壁接种3～6 d，光学显微镜下可见组织块周围有大量的亮点，少量细胞从组织块爬出，有长梭形、圆形和不规则的多角形，但以长梭形为主（图2A）。7～9 d，可见大量细胞爬出，细胞形态以长梭形为主，仍然存在少数多角形和圆形细胞（图2B）。9～10 d用1 mL枪头轻轻吸出组织块。15～20 d，细胞数量明显增多，以典型的长梭形为主，达到90%融合（图2C）。培养出来的细胞传至第三代时，可见成纤维细胞样细胞多单一长梭形且分布均匀（图2D）。

2.3 AA兔成纤维样滑膜细胞生长曲线

通过MTT法检测P3佐剂关节炎兔成纤维样滑膜细胞增殖能力，绘制出来的细胞生长曲线呈现典型的“S”形，并且细胞的活性较强（图3）。

2.4 AA兔成纤维样滑膜细胞的鉴定

免疫荧光检测结果显示，改良组织块法分离得到的AA兔成纤维样滑膜细胞表达中胚层组织特征性波形蛋白，用武汉千屏HPIAS-1000彩色图像采集系统分析细胞的阳性率达98%以上（图4）。

图1 新西兰兔足关节及足爪的病变特征Figure 1 Histopathological changes of joints and toes in New Zealand white rabbits

图2 原代关节炎兔成纤维样滑膜细胞培养（100×）Figure 2 Primary culture of rabbit with adjuvant arthritis fibroblast-like synoviocytes （100×）

图3 关节炎兔成纤维样滑膜细胞生长曲线Figure 3 The growth curve of fibroblast-like synoviocytes from rabbit with adjuvant arthritis

3 讨论

虽然目前对RA的研究已经深入到细胞水平、分子水平以及基因水平，但RA的病因和发病机制极其复杂，在医学上仍是世界性难题［7］。据临床观察RA的主要病理特征为： 关节滑膜炎，滑膜组织增生以及对骨和软骨的结构性损伤。动物模型是研究RA的重要手段之一， 而比较经典的动物造模方法是弗氏完全佐剂诱导的关节炎，造模后关节炎变化可涉及多个关节， 也引起全身症状［8］。本研究中将兔作为研究对象，采用多次多点于新西兰兔右跖部皮下注射弗氏完全佐剂诱导AA兔模型，造模3周后，外部观察足关节及足趾部明显肿胀，严重致跛行，解剖可见模型兔足趾部有明显微血管增生和炎症，这些表现与类风湿关节炎相符。

图4 免疫荧光检测波形蛋白表达情况Figure 4 The expression of vimentin by immunofluorescence staining

原代细胞培养主要有机械分散法、组织块培养法和酶消化法［9］。该实验采用改良组织块法成功分离培养出兔成纤维样滑膜细胞，与传统的组织块贴壁法相比，最大的优点就是大大缩短了组织块贴壁时间且操作简单，组织块置于培养皿之前进行了吸水处理后，只需要放置培养箱5 min后，就可以很牢固贴在培养皿上，之后加一半培养液即可，24 h后补加剩下的一半培养液就行了，而传统组织块法由于没有进行吸水处理，组织块贴壁时间需要2～4 h，并且贴得不够牢固，稍微操作不当组织块就会漂浮起来，就很难长出细胞。本实验培养出的第3代兔成纤维样滑膜细胞呈现典型的“S”形，与文献报道［10］一致。传至5～6代后，细胞逐渐老化，7～8代后活性几乎丧失，老化停止增殖，建议采用3～4代细胞进行相关实验。当细胞大量增殖后可置液氮灌中低温长期保存，为后续实验开展提供细胞来源。但在采用改良组织块法分离培养兔成纤维滑膜细胞的过程中，关节滑膜组织的取材最关键的环节，直接影响着能否成功培养出所需要的细胞，在实验前期通过反复的摸索才掌握滑膜组织的取材方法。

［1］ 唐艳丽， 谢映梅， 王少慧， 等.中药组方羌活、独活、防风及木瓜联合甲氨蝶呤对佐剂性关节炎新西兰白兔TNF-α、IL-1β、VEGF分子及 mRNA的影响［J］.免疫学杂志， 2014， 30（3）：235-238.

［2］ 强宇靖， 罗奎元， 高慧琴.类风湿性关节炎动物模型研究进展［J］.甘肃中医学院学报， 2015， 32（6）：74-76.

［3］ Bendele AM.Animal models of rheumatoid arthritis［J］.Musculoskel Neuron Interact， 2001， 1（4）：377-385.

［4］ 邹仲之， 蔡文琴， 徐晨， 等.组织学与胚胎学［M］.北京： 人民卫生出版社， 2004：54-55.

［5］ Turner JD， Filer A.The role of the synovial fibroblast in rheumatoid arthritis pathogenesis［J］.Curr Opin Rheumatol，2015， 27（2）：175-182.

［6］ 梅焕平， 张源潮， 杨清锐， 等.青紫兰家兔佐剂性关节炎的诱导方法研究［J］.中华风湿病学杂志， 2002， 6（5）：278-279.

［7］ 冯春荣， 李兆翌， 黄真.中药治疗类风湿性关节炎的实验研究进展［J］.中国现代药物应用， 2010， 4（2）：228-230.

［8］ 强宇靖， 罗奎元， 高慧琴.类风湿性关节炎动物模型研究进展［J］.甘肃中医学院学报， 2015， 32（6）：74-77.

［9］ 司徒镇强， 吴军正.细胞培养［M］.西安： 世界图书出版西安公司， 2009：57-63.

［10］ 秦苏萍， 孙德旭， 李慧， 等.CIA 大鼠滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定［J］.免疫学杂志， 2014， 30（12）：1096-1099.

［Abstrat］ Objective To establish an easier and better method for primary culture of an adjuvant arthritis rabbit fibroblast-like synoviocytes （FLS） by modified tissue cell culture， and then to investigate the biological characteristics of cultured cells.Method The rabbits were injected with Freund's adjuvant complete to establish the model of adjuvant arthritis.The joint synovial layers of rabbits with adjuvant arthritis were cut into small pieces and siphoned off water attached on the tissues with sterile filter paper and then cultured.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rd passage cells was measured by 3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide （MTT） assay， and the expression of vimentin tested by immunocytochemistry.Results The in vitro cultured fibroblast-like synoviocytes FLS from rabbit with aduvant arthritis exhibited spindle-shaped appearance and could rapidly expand， and the cells highly expressed vimentin.Conclusion Primary culture of an adjuvant arthritis rabbit FLS by the improved explant culture method is successfully established.The method is simple and high efficient.It can provide a new method for the isolation of FLS.

Isolation and Primary Culture of Fibroblast-like Synoviocytes Using Modified Explant Culture Method from Rabbit with Aduvant Arthritis

CHEN Fang1， CHEN Li-feng2， LIU Qin1， WANG Li-ping1， ZHANG Yi1
（1.Department of Medical Experiments； 2.Department of Integrated Traditional and Western Medicine，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command， Wuhan 430070， China）

Arthritis； Rabbit； Fibroblast-like synoviocytes （FLS）； Modified explant culture

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0280-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.007

2016-02-26

湖北省卫生厅中医药科研课题（2013Z-Y37）； 广州军区武汉总医院课题（YZ201422）

陈 芳（1979-）， 女， 硕士， 从事中药药理及细胞生物学研究。E-mail： wpcf401717@163.com

陈利锋。E-mail： Bee-cheng368@126.com