悬液芯片技术在实验兔病原体检测中的应用

张超超， 黄小燕， 樊海艇， 潘 裕， 赵 源， 黄珍祯， 孙 涛（上海中医药大学实验动物中心， 上海201203）

悬液芯片技术在实验兔病原体检测中的应用

张超超， 黄小燕， 樊海艇， 潘 裕， 赵 源， 黄珍祯， 孙 涛
（上海中医药大学实验动物中心， 上海201203）

［编者按：由于生物技术的快速发展，各种检测技术和手段不断涌现。实验动物病原体检测方法虽然有国家标准规定，但随着我国的科学研究与国际接轨以及全球化进程，实验动物病原体检测需要应用新的技术和手段。本文作者应用悬液芯片技术检测实验兔病原体的尝试，或可为我国实验动物病原体检测提供参考。］

目的 应用悬液芯片技术实验兔几种病原体的自然感染情况。方法 从8家实验兔生产单位采购80只实验兔（7家普通级，1家清洁级），运用悬液芯片技术进行微量、快速、高通量的血清学检测。结果 各单位实验兔病原体感染较为普遍，其中轮状病毒（ROTA）和呼吸道鞭毛杆菌（CARB）的抗体阳性率分别高达72.5%和80%、； 呼肠弧III型病毒（REO-3）、脑胞内原虫（ECUN）和泰泽氏病原体（CPIL）的抗体阳性率为21.25%、17.5%和10%； 而清洁级实验兔只存在脑胞内原虫（ECUN）和泰泽氏病原体（CPIL）的感染，所有动物均不存在淋巴脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）和弓形虫（TOXO）感染。结论 应用悬液芯片技术可以快速检测实验兔病原体。

实验兔； 悬液芯片技术； 血清学； 病原体

实验动物质量检测是保障实验动物质量的重要技术手段，北京、上海、湖南等地先后做过这方面的调查研究［1-3］。实验兔作为一种重要的实验动物，其动物质量尤其是微生物学质量必将影响实验结果的准确性［4］。实验动物微生物学质量检测方法在国家标准中有明确规定，但新技术新方法的应用可为常规检测提供参考。

悬液芯片技术［5］是一种快速、特异、敏感的检测新技术［6-8］，该技术具有微量、快速和高通量的特点［9］，作者应用该技术检测了本地区几家单位的实验兔病原体感染情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验兔由本地区8家拥有实验动物生产许可证的单位提供， 每家10只， 共80只， 均为雄性， 体质量2.0～2.5 kg。其中1家为清洁级，7家为普通级。

1.2 试剂

多重免疫荧光分析缓冲液（MFIA Assay Buffer）；小牛血清； 防腐剂ProClin300； 初次稀释液（Primary Diluent）； 磁珠； 兔高免和低免对照液（RbAsmnt High，RbAsmntLow）； 兔轮状病毒； 兔非免疫对照液（Non-immune Rabbit）； Diluent稀释液； 抗兔抗体和抗仓鼠IgG（BAG）； 链霉亲和素（SPE），以上试剂均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.3 仪器及数据处理

Bio-Plex-200悬液芯片系统购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司； 运用Workbook软件进行数据处理，该软件由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 血清样品采集 通过实验兔耳缘静脉采集1 mL血液样本， 3 000 r/min离心15 min， 取血清， 置-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 操作过程 制作空白板图； 每孔加入100 μL多重免疫荧光分析缓冲液湿润整个测试板，抽滤；每孔加入50 μL微珠； 加入各对照样本和待测样本50 μL，用铝箔包裹， 避光， 置于振荡器， 600 r/min，60 min，抽滤；每孔加入100 μL 多重免疫荧光分析缓冲液，抽滤，重复2次； 每孔加入50 μL 多重免疫荧光分析缓冲液，加入50 μBAG，避光，600 r/min震荡30 min， 抽滤； 每孔加入100 μL 多重免疫荧光分析缓冲液，抽滤，重复2次； 每孔加入50 μL多重免疫荧光分析缓冲液， 加入50 μSPE， 避光，600 r/min震荡30 min， 抽滤； 每孔加入100 μL多重免疫荧光分析缓冲液，抽滤，重复2次； 每孔加入125 μL 多重免疫荧光分析缓冲液，600 r/min震荡1 min，底部加膜，放入Bio-Plex读板。检测病原体有以下7种： 呼肠弧Ⅲ型病毒（REO-3）、轮状病毒（ROTA）、淋巴脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）、脑胞内原虫（ECUN）、泰泽氏病原体（CPIL）、呼吸道鞭毛杆菌（CARB）和弓形虫（TOXO）。

2 结果

结果表明，各单位实验兔病原体抗体阳性率的情况较为普遍，其中CARB和ROTA的阳性率为80%和72.5%； REO-3、ECUN和CPIL的阳性率分别为21.25%、17.5%和10%； 未检出LCMV和T0X0，具体数据详见表1。

通过表1可看出，其中1家生产单位的实验兔（清洁级）未检出CARB和ROTA，只有少数检出ECUN和CPIL的抗体阳性。

而普通级实验兔中CARB和ROTA的抗体阳性率达91.4%和72.5%、REO-3、ECUN和CPIL的阳性率分别为21.25%、14.29%和7.14%，而LCMV和弓形虫TOXO都未见感染。

表1 各单位实验兔病原体血清学检测结果

3 讨论

实验兔作为一种重要的实验动物，是实验研究中一个必不可少的基础实验对象［10］。本次实验兔采样范围的血清学检测结果表明，实验兔病原体抗体阳性率较为普遍，其中ROTA和CARB最高，其次REO-3、ECUN和CPIL，但未检测到LCMV和TOXO感染。清洁级实验兔没有检测到普通级实验兔存在的主要病原体感染，但还存在ECUN和CPIL的感染［11，12］。说明严格的饲养条件是控制实验动物质量的主要手段，其中阳性率最高的CARB恰恰与实验动物的饲养环境有关也从侧面印证了这点［13］。所以应加强实验兔的饲养管理，并做好实验兔病原体监测及预防控制工作。另外，此次检测的7种病原体中除了CARB，其余6种病原体在我国国家标准中都有列出，但是只有3种为必检项，是否需要调整必检项目，有待商榷。

同时， 与传统的检测方法相比， 悬液芯片技术体现了微量、快速、高通量的特点［14］。80只实验兔样本， 每只动物只需采集1 mL血样， 同时能对7种病原体进行多重检测［15］，所有样本检测时间只需3～4 h［16］。悬液芯片技术的成熟应用［17］， 可以为实验兔病原体提供一种新的检测方法［18］。该项检测技术在国外已成熟运用于病原体检测［19-21］。此次检测用试剂是美国Charles River公司的专利产品， 它是根据美国地区的实验兔感染特点制定的特殊试剂［22］，其中LCMV和TOXO在此次调查中均未检出， 其原因有待进一步研究。如果国内能够开发出适合相应国家标准和我国实验兔病原体流行情况的专用检测试剂， 或可促进国内实验动物病原体检测技术的发展。

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1674-5817（2016）04-0307-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.012

2016-04-01

张超超（1981-）， 男， 实验师， 从事实验动物科学及管理。E-mail： stonezcc@163.com

孙 涛（1968-）， 男， 研究员， 研究方向： 病毒与免疫学。E-mail： tao.sun@sjtu.edu.cn