穴位贴敷对哮喘大鼠嗜酸粒细胞及肺组织超微结构的影响

乔 明， 杨正明， 黄 谦， 刘兰英（.连云港市中医院， 连云港000； .江苏省中医院， 南京 0000）

穴位贴敷对哮喘大鼠嗜酸粒细胞及肺组织超微结构的影响

乔 明1， 杨正明1， 黄 谦1， 刘兰英2
（1.连云港市中医院， 连云港222000； 2.江苏省中医院， 南京 210000）

目的 观察穴位贴敷对哮喘大鼠嗜酸粒细胞及肺组织超微结构的影响。方法 参考Palmans方法建立哮喘大鼠模型，观察予穴位贴敷治疗后大鼠全血白细胞数量和嗜酸粒细胞值以及肺组织超微结构变化。结果 模型组大鼠全血白细胞和嗜酸粒细胞较正常组明显增加，各治疗组大鼠全血白细胞和嗜酸粒细胞较模型组明显减少。穴位贴敷可有效改善哮喘大鼠肺泡上皮细胞结构。结论 穴位贴敷可以减少大鼠全血白细胞和嗜酸粒细胞数量，减轻哮喘大鼠肺组织炎症细胞浸润及肺泡上皮细胞坏死，从而发挥治疗哮喘的作用。

穴位贴敷； 哮喘； 嗜酸粒细胞； 肺组织； 超微结构； 电子显微镜

哮喘是由多种细胞包括气道的炎性细胞和结构细胞（如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分（cellular elements）参与的气道慢性炎症性疾病［1］。激素治疗是最有效的控制气道炎症的方法之一，但其长期使用会出现激素依赖与抵抗现象，导致病情易反复发作，患者依从性较差。

穴位贴敷是中医外治法之一，它依据冬病夏治理论，在三伏天穴位贴敷治疗支气管哮喘可减轻该病复发程度及次数。穴位贴敷治疗哮喘简便易行，疗效明确，但是作用的机制尚不明确。为研究穴位贴敷治疗哮喘的作用机制，作者建立了大鼠哮喘模型。观察穴位贴敷对哮喘大鼠肺组织上皮细胞及血液中白细胞及嗜酸粒细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6 周龄SPF级雄性Wistar大鼠32只，上海西普尔必凯实验动物有限公司提供［SCXK（沪）2013-0016］， 随机分成4组，分别为正常组（A）、模型组（B）、地塞米松组（C）、穴位贴敷组（D）， 每组8只。

1.2 仪器

鱼跃402A型超声雾化器， 江苏鱼跃医疗设备股份有限公司； 自制非完全密闭箱（30 cm×40 cm×50 cm）； JEM1200型射电镜， 日本电子； Coulter LH750型全自动血液分析仪， 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 试剂

卵蛋白（OVA）： 美国Sigma公司生产，GradeⅤ5503； 氢氧化铝（分析纯）： 天津博迪化工股份有限公司； 地塞米松磷酸钠注射液（1 mL∶5 mg）： 山西晋新双鹤药业； 水合氯醛： 由南京中医药大学实验中心提供， 临用前用蒸馏水配置成质量分数10%的水合氯醛溶液（10 mL： 1 g）； 质量分数2.5%戊二醛： 货号MAIDF0151， 北京麦瑞博生物科技有限公司； 质量分数1%锇酸： CAS号： 20816-12-0， 美国斯百全公司。

1.4 穴位贴敷药

南京中医药大学附属医院制剂部制备， 药物组成： 延胡索、白芥子各2份， 细辛、生甘遂、麻黄、生川乌、牙皂、桂枝、丁香、葶苈子各1份，打粉后加生姜汁， 合凡士林做成0.5 cm×0.5 cm大小药丸（重约0.3 g，相当于生药量约0.15 g），用胶布固定制成贴剂。

1.5 大鼠哮喘模型建立

参考Palmans方法［2］制备OVA致敏的哮喘大鼠模型。第1日给予B， C， D组大鼠腹腔注射OVA和氢氧化铝混合溶液1 mL（含OVA10 mg、氢氧化铝100 mg）， 第8日再次腹腔注射加强致敏。第15日开始， 将B， C， D组大鼠置于自备密闭雾化箱内，给予质量分数1%OVA溶液100 mL超声雾化，隔日1次，每次30 min。直到第56日雾化结束。大鼠出现烦躁、呼吸频率加快、腹式呼吸明显、点头运动、可闻及哮鸣音等症状，提示造模成功［3］。

1.6 治疗

第57日起对C，D组进行治疗。A、B组： 正常喂养。C组： 地塞米松1 mg/kg， 每日1次腹腔注射。D组： 咳喘停贴剂外用于双侧肺俞、脾俞、肾俞穴［4］（每鼠用药量1.8 g/次， 相当于生药量约1 g/次），6 h后去除，每日1次。共治疗14 d。治疗结束后取材观察。

1.7 取材

治疗结束后， 用10%水合氯酸（按每鼠3.5 mL/kg），腹腔注射麻醉。采集颈静脉血1 mL，装于EDTA抗凝管中，在全自动血液细胞分析仪上测定白细胞总数（RBC）和嗜酸粒细胞（EOS）百分比。取肺组织（1 mm×1 mm×1 mm）大小，用2.5%戊二醛固定2 h后漂染，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，透射电镜观测肺组织的超微结构。

1.8 统计学处理

采用SPSS20统计软件， 检测结果以x- ± s表示，应用正态分布、方差齐的组间差异性比较采用单因素方差分析； 非正态分布或者方差不齐，采用多个独立样本的非参数检验（Kruskal-Wallis H检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘大鼠全血RBC和EOS百分比

结果显示，模型组大鼠全血RBC和EOS较正常组明显增加（P＜0.05），各治疗组大鼠全血RBC和EOS较模型组明显减少（P＜0.05）（表1）。

2.2 哮喘大鼠肺组织超微结构

在电子显微镜下： 正常大鼠肺组织肺泡壁表面的上皮细胞结构良好，表面微绒毛形态正常，排列整齐（图1A）； 哮喘大鼠肺组织肺泡上皮细胞板层小体排空现象较多，细胞表面微绒毛明显减少，排列混乱（图1B）。经地塞米松治疗后肺泡上皮细胞板层小体仅部分空泡化，细胞表面微绒毛有所减少（图1C）。穴位贴敷组肺泡上皮细胞板层小体仅部分空泡化，肺泡上皮增生，细胞表面微绒毛有所减少（图1D）。

表1 穴位贴敷对哮喘大鼠全血RBC和EOS的影响

3 讨论

目前治疗哮喘最有效、最常用的依然是糖皮质激素。但应用激素仍不能较好改善哮喘复发情况，却带来患者依从性差及药物依赖性等许多问题。南京中医药大学附属医院通过改良《张氏医通》中白芥子、延胡索、甘遂、细辛这一贴敷传统剂型，降低了药物的刺激性，而保留了治疗哮喘的有效成分，加强了穴位贴敷的安全性和有效性。从本次试验可以看到穴位贴敷及地塞米松对EOS和哮喘肺组织微结构的影响。

EOS释放的白三烯及碱性蛋白等化学物质是导致气道高反应性和加重气道炎症反应的重要因素［5］。当EOS在肺组织发生聚集并释放一系列促炎症反应及细胞毒素产物，引起肺组织上皮损伤增加了气道反应性从而导致哮喘的发作。各治疗组大鼠全血中RBC和EOS百分率明显下降，提示穴位贴敷治疗哮喘可能通过减少大鼠血和气道中RBC和EOS数量减少炎性细胞尤其是EOS在肺组织中的浸润，减轻哮喘气道炎症反应，从而发挥平喘作用。

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病， 在显微镜下可见气道上皮下有肥大细胞、肺泡巨噬细胞、EOS、淋巴细胞与中性粒细胞浸润。气道粘膜下组织水肿， 微血管通透性增加， 支气管内分泌物贮留，支气管平滑肌痉挛， 纤毛上皮剥离， 基底膜露出， 杯状细胞增殖及支气管分泌物增加等病理改变。

图1 大鼠肺组织超微结构观察

肺泡上皮细胞形态学的改变可以较好反映气道慢性炎症等病理变化情况。据研究表明哮喘大鼠肺间质内有大量纤维组织增生，组织内有大量单核细胞淋巴细胞嗜酸性粒细胞等细胞浸润，肺泡Ⅱ型细胞板层小体和线粒体较少，而且有明显排空和空泡化改变［6］。

电子显微镜观察大鼠肺组织的肺泡上皮细胞显示，穴位贴敷可有效改善哮喘大鼠肺泡上皮细胞结构，且疗效与地塞米松疗效无明显差异，提示穴位贴敷能通过减轻肺泡上皮细胞坏死达到治疗哮喘的目的。

本实验提示， 穴位贴敷可抑制哮喘大鼠炎症细胞浸润， 通过减轻肺泡上皮细胞坏死从而发挥类似于糖皮质激素治疗哮喘作用。穴位贴敷疗法具有简便易廉的特点， 值得在治疗哮喘这一疾病中推广应用。

本次实验缺少对贴敷次数及贴敷时间的对比研究，在以后研究中应进一步加强贴敷时效研究为更科学的安排治疗时间提供依据。

［1］ 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南（2008年修订版）［J］.中华结核和呼吸杂志， 2008， 31（3）：177-185.

［2］ Palmans E， Kips JC， Pauwels RA， et al.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats ［J］.Am J Respir Crit Care Med， 2000， 161（21）：627-635.

［3］ 乔明， 刘兰英， 王和生.慢性过敏性哮喘大鼠模型的建立与评价［J］.实验动物与比较医学， 2014， 34（1）：79-82.

［4］ 李忠仁.实验针灸学［M］.北京： 中国中医药出版社， 2003：325-326.

［5］ Lee CC， Huang HY， Chiang BL.Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness［J］.Hum Gene Ther， 2011， 22（5）：577-586.

［6］ 郁志伟， 张建华.布地奈德对哮喘小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响 ［J］.临床儿科杂志， 2009， 27（9）：870-872.

Effect of Acupoint Sticking Therapy on Eosinophils and Ultrastructure of Lung Tissue in Asthmatic Rats

QIAO Ming1， YANG Zheng-ming1， HUANG Qian1， LIU Lan-ying2
（1.Lianyungang Hospital of TCM， Lianyungang 222000， China；
2.Jiangsu Province of TCM， Nanjing 210000， China）

Objective To observe the effect of acupoint sticking therapy on eosinophils infiltration and the lung tissue ultrastructure of asthmatic rats.Methods Using rat model of asthma which is established following Palmans’ method， we observed the effect of acupoint sticking therapy on the whole blood leukocyte count， eosinophils and ultrastructural changes in lung tissue.Results The whole blood leukocytes and eosinophils counts were significantly increased in asthma model group compared with the sham group.After treatment with acupoint sticking therapy， the whole blood leukocytes and eosinophils counts were significantly decreased and the ultrastructure of alveolar epithelial cells was also obviously improved in asthma rats.Conclusion Acupoint sticking therapy can reduce the whole blood leukocytes and eosinophils counts and alleviate inflammatory cell infiltration and alveolar epithelial cell necrosis in the lung of asthmatic rats to treat asthma.

Acupoint sticking therapy； Asthma； Eosinophils； Lung Tissue； Ultrastructure； Electron microscope

R33-33 Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0276-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.006

2016-03-24

国家自然科学基金（81102632）

乔 明（1991-）， 男， 硕士， 针灸推拿。E-mail： 470522236@qq.com