瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制

杨蕾,刘海龙，张斌，汤建民

(郑州大学第二附属医院，郑州450000)



瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制

杨蕾,刘海龙，张斌，汤建民

(郑州大学第二附属医院，郑州450000)

目的探讨瑞舒伐他汀对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法 从60只SD雄性大鼠中随机抽取10只作为对照组，只分离不结扎前降支，余下的50只分别结扎其前降支制作AMI模型。24 h后存活的41只随机分为3组，分别为AMI组13只、Statin1组14只、Statin2组14只。术后第1天起，Statin1、2组分别给予瑞舒伐他汀1.5、3.0 mg/(kg·d)灌胃,对照组及AMI组分别以等量的生理盐水灌胃。4周后TUNEL法染色检测心肌细胞凋亡指数(AI)，免疫组化法检测线粒体融合蛋白2(Mnf2)表达，免疫印迹法检测磷酸化Akt(p-Akt)表达，并进行比较。结果与对照组相比，AMI组及Statin1、Statin2组心肌细胞AI升高，p-Akt表达下降，Mnf2表达增加(P均<0.05)；与AMI组相比，Statin1、Statin2组心肌细胞AI和Mnf2表达均显著降低(P均<0.05)，而p-Akt表达增高(P<0.05)，且Statin2组较Statin1组变化更为显著(P<0.05)。结论 瑞舒伐他汀可抑制大鼠AMI后的细胞凋亡，其作用可能与下调Mnf2的表达有关，且呈一定剂量依赖性。

急性心肌梗死;细胞凋亡;线粒体融合蛋白2; Ras-PI3K/Akt；瑞舒伐他汀;大鼠

急性心肌梗死(AMI)后坏死心肌介导的炎症反应，在促进坏死心肌修复愈合的同时，也加速心肌的重构并通过细胞因子的级联效应导致心肌细胞凋亡。线粒体融合蛋白2(Mfn2)是线粒体外膜上的一种跨膜蛋白，其可能通过激活线粒体凋亡途径，或抑制Ras-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B (PKB)通路，诱导心肌细胞发生凋亡[1]。他汀类药物除抑制甲羟戊酸合成，还可抑制类异戊二烯的生成，影响Ras-PI3K/Akt通路，发挥其调节细胞凋亡、改善血管内皮功能、抗血小板、调脂、抗动脉粥样硬化等作用[2]。本实验于2015年4～10月建立大鼠AMI模型，研究瑞舒伐他汀对AMI大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料健康成年SPF级SD雄性大鼠60只，体质量250～300 g，购自山西医科大学实验动物中心。试剂及药品：Mfn2兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；PV9000试剂盒、DAB试剂盒(北京中杉生物工程公司)；凋亡试剂盒(德国roche公司)；瑞舒伐他汀钙片(10 mg/片)，AstraZeneca公司。仪器：日本尼康显微照像系统；微波炉(格兰仕)；温箱(电热恒温水浴箱DHG-9031,上海)；电子天平(BS224S,德国)。

1.2动物分组及模型建立健康成年SPF级SD雄性大鼠60只，适应性喂养7 d。随机抽取10只为对照组，前降支下穿线不结扎；其余50只制作AMI模型：用10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，气管切开插管，呼吸机辅助呼吸，潮气量15 mL/kg,呼吸频率70～80次/min，呼吸比2∶1，开胸后分离胸膜、心包，挤出心脏，以医用缝线穿圆形塑料套管前结扎大鼠左前降支阻断血流，造成AMI模型。24 h后存活41只大鼠，按照随机数字表法分为3组，AMI组13只、Statin1组14只、Statin2组14只，术后第1天起Statin1、2组分别给予瑞舒伐他汀1.5、3.0 mg/(kg·d)灌胃，对照组及AMI组均以等量生理盐水灌胃，每3天称重1次并调整给药剂量,共给药4周。实验结束时各组存活量分别为对照组10只、AMI组9只、Statin1组11只、Statin2组13只。

1.3心肌细胞凋亡指数(AI)的测算用转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(TUNEL)对组织石蜡切片行凋亡染色。凋亡细胞出现棕黄色颗粒为阳性，每张标本取3张切片，每张切片在心梗区域随机取5个高倍镜视野，记录阳性细胞数，计算AI，AI=凋亡细胞核数/总细胞核数×100%。

1.4心肌组织中Mfn2表达的检测采用免疫组化法。处死大鼠后取心脏标本，制作石蜡切片，选取梗死心肌组织边缘区域(对照组在左室前壁)切片。依照试剂盒步骤检测Mfn2。阳性切片作阳性对照，PBS切片作阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性，每张标本取3张，分析Mfn2蛋白阳性染色指数(阳性细胞数/视野细胞总数×100%)。

1.5心肌组织中p-Akt表达的检测采用免疫印迹法。提取组织总蛋白，测定蛋白浓度。 蛋白上样量为50 μg，经电泳、转膜、封闭后，加入一抗(抗α-actin、抗p-Akt、抗Akt)，4 ℃放置12 h以上，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，平稳摇动，室温放置2 h后检测。

2　结果

2.1各组AI、Mfn2比较见表1。

2.2各组心肌组织 p-Akt 的表达比较与对照组比较，AMI组及Statin1、Statin2组心肌组织中p-Akt蛋白表达均降低(P均<0. 01);与AMI组比较，Statin1组、Statin2组p-Akt表达增加(P均<0.05) ，以Statin2组为著(P<0.05) ，见图1、表1。

图1　各组p-Akt表达的免疫印迹图

组别AIp-AktMfn2对照组084.50±5.080.0480±0.0030*AMI组0.6087±0.0613*9.52±0.09*0.8850±0.0155*Statin1组0.3915±0.0334*#17.85±1.18*#0.6248±0.0558*#Statin2组0.2626±0.0297*#@28.35±2.29*#@0.3875±0.0478*#@

注：与对照组比较,*P<0.05;与 AMI组比较，#P<0.05; 与Statin1组比较，@P<0.05。

3　讨论

既往认为AMI时以心肌细胞坏死为主。近年来多项相关动物实验证实，AMI后细胞凋亡才是心肌细胞死亡的主要方式[3]。Kajstura等[4]在AMI动物模型中发现，梗死后约6 h心肌细胞凋亡可达到高峰，7 d仍有大量的心肌细胞发生凋亡。Bardales等[5]用TUNEL法检测85例AMI死亡患者尸解的心肌细胞，凋亡率超过90%。

AMI发生后，缺氧、缺血、再灌注等诱因激活各种凋亡因子，调控相关信号通路,诱导细胞凋亡[6]。细胞凋亡信号转导为多途径且相互影响，研究发现,Ras-PI3K/Akt 路径是促使心肌细胞发生凋亡的主要通路[7]。本实验结果显示,AMI组较对照组细胞凋亡明显增多，同时心肌组织中p-Akt表达较对照组也明显降低。以上结果均表明AMI后大量心肌细胞凋亡，与Ras-PI3K/Akt通路激活密切相关。

原癌基因Ras不仅能调控PI3K/Akt 通路，诱导细胞凋亡，还可通过PI3K非依赖型途径直接激活Akt[8]。研究表明，Mfn2在心肌、骨骼肌和脑组织中高表达，其可能参与心肌细胞凋亡的早期活化，加速线粒体分裂，促使线粒体体积减小[9]。Mfn2对Ras有直接负调控作用，能阻滞Ras-PI3K/Akt 通路，抑制Akt磷酸化，继而使B淋巴细胞瘤-2基因表达减少，促凋亡基因Bax表达增加，通过线粒体相关途径参与细胞凋亡[10]。本实验结果显示,大鼠AMI造模成功后，梗死及周围心肌组织Mfn2表达明显增高，p-Akt表达明显降低，这表明梗死后损伤激活Mfn2的表达，弱化Akt 磷酸化从而促发心肌细胞凋亡。

大量的循证医学证实，他汀类药物在冠心病防治过程中占据着不可替代的地位。随着临床广泛应用及研究的深入，人们发现他汀类药物有重要的独立于调脂外的多重作用[11]：他汀类药物除抑制甲羟戊酸合成，阻断Cho的生成过程，还可抑制类异戊二烯，可与一些单体G蛋白(如Ras，Rho等)偶联，增加后者的亲脂性，影响Ras-PI3K/Akt 及Rho/Rho激酶信号通路、RAAS系统和过氧化物酶增殖物激活受体的活性，发挥其抑制心肌细胞凋亡、改善血管内皮功能、调脂、抗动脉粥样硬化等作用，降低心血管疾病的发病率和病死率[2]。本实验结果显示,瑞舒伐他汀可使Mfn2表达明显下调，抑制Ras相关信号通路的活化，减少大鼠AMI后的细胞凋亡，其作用表现出一定的剂量依赖性。

综上所述，笔者认为Ras介导的PI3K/Akt信号通路可能在AMI后心肌细胞凋亡发生发展过程中起重要作用，而瑞舒伐他汀通过下调Mfn2表达，上调p-Akt水平，最终减少AMI后心肌细胞凋亡，防止AMI范围进一步扩大导致心肌细胞坏死，从而对心功能不全及心室重构有一定的治疗作用。

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汤建民(E-mail：tjmgrx@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.009

R541.4

A

1002-266X(2016)17-0028-03

2015-11-18)