银杏叶提取物对OSAS继发性高血压大鼠的治疗作用及其机制

李艳红，陈梅晞

(1 桂林医学院，广西桂林 541001;2 桂林医学院附属医院)



银杏叶提取物对OSAS继发性高血压大鼠的治疗作用及其机制

李艳红1，陈梅晞2

(1 桂林医学院，广西桂林 541001;2 桂林医学院附属医院)

目的探讨银杏叶提取物(GBE)对阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)继发性高血压大鼠的治疗作用及其机制。方法 参考罗荧荃的经典造模方法设立大鼠间歇缺氧(IH)模型。将30只Wistar大鼠随机分为常氧对照(NC)组、IH组、GBE治疗(IH+GBE)组，实验前及实验后第3、6、9周监测血压及生理状态变化，9周后提取各组肾周前脂肪细胞并鉴定，用MTT法检测12.5、25、50、100、200、400 mg/L的GBE作用3、6、12、24 h后的细胞活力及增殖率；提取IH组前脂肪细胞，将其分为缺氧对照组(IH组)、LPS刺激缺氧组(LPS组)、GBE治疗缺氧组(GBE组)，12 h后ELISA法检测上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6。结果 ①IH组与NC组比较大鼠尾动脉血压随着缺氧时间而增加(P<0.05或<0.01)，IH+GBE组随着缺氧时间的延长血压维持在正常水平；②GBE在一定程度上能促进大鼠前脂肪细胞生长, 呈剂量、时间依赖性(P均<0.05)；③与IH组比较，LPS组上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，GBE组显著降低(P均<0.01)。结论 GBE对OSAS引起的高血压大鼠有治疗作用；其可能通过促进前脂肪细胞增殖、抑制脂肪细胞因子水平，改善OSAS炎症程度而起作用的。

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征；高血压；银杏叶提取物；脂肪细胞；炎性因子；大鼠

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)作为难治的慢性呼吸系统炎性疾病[1]，是继发性高血压的高危因素，其机制可能是反复间歇性缺氧(IH)引起细胞缺氧再灌注损伤，并触发促炎基因的大量表达，加重血管内皮和功能损害，从而引起患者高血压发生[2]，目前临床上尚无较好的治疗方案。肥胖为OSAS和高血压的危险因素，三者之间形成恶性循环，互相加重，严重威胁公众健康。美国关于肥胖和高血压的相关性统计分析指出肥胖是引起高血压的重要因素[3]。新的研究[4]也表明脂肪细胞除了存储能量，还具有内分泌及调节血压的功能，如脂肪因子chemerin的过度合成可引起血管重构及炎症反应，与高血压的发生密切相关[5]。由此猜测脂肪细胞分泌的炎性因子可能参与了OSAS与高血压的病理生理过程。银杏叶提取物(GBE)现被广泛用于治疗多种心脑肺血管疾病，具有清除自由基、抗脂质过氧化等作用[6]。2014年11月～2015年1月，我们通过研究GBE对OSAS大鼠血压的影响，并分析其对脂肪细胞生长及脂肪细胞因子的调控作用，以探讨其治疗作用及机制。现报告如下。

1　 材料与方法

1.1材料SPF级Wistar大鼠30只，雄性，体质量120～150 g，由桂林医学院实验动物中心提供，许可证号SCXK桂2013-0001,前脂肪细胞由大鼠肾周脂肪组织提取；GBE(徐州恒凯银杏制品有限公司)； JXOC-12型低压氧舱全自动控制仪，包括有机玻璃舱、XF-666型测氧仪、氮气储气瓶、氧气储气瓶四部分(南京新飞分析仪器制造有限公司)；ALC-NIBP型大鼠尾动脉血压测量仪(上海奥尔科特生物科技有限公司)；氮气、氧气(桂林恒盛气体有限公司)；细胞培养基、胎牛血清(Hyclone公司)；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT(Amresco公司)；脂多糖(LPS)、DMSO、油红O(索莱宝公司)；IBXM紫外分光光度计(日本岛津UV-2401PC)；ELISA试剂盒(华美公司)。

1.2动物模型分组及建立参考罗荧荃等[7]的经典造模方法，取Wistar大鼠随机分为常氧对照(NC)组、IH组、GBE治疗(IH+GBE)组各10只，每天实验前分别予以对照组和IH组生理盐水灌胃，IH+GBE组给予1 mL/kg GBE水溶剂灌胃，1次/d，共9周。实验期间IH组和IH+GBE组大鼠放置于密闭的玻璃容器中予以8 h循环向玻璃舱内充入氮气、氧气，即快速充入10 s的氮气维持低氧(6%±0.5%) 30 s后10 s内快速充入氧气维持氧浓度为(21%±0.5%) 30 s，最终以9周后尾动脉收缩压≥150 mmHg提示OSAS合并高血压造模成功。

1.3大鼠生理状态的改变及血压的监测实验前及实验后3、6、9周用无创血压记录仪分别监测各组尾动脉血压的变化情况，并观察大鼠鼻唇、呼吸等变化情况。

1.4前脂肪细胞的提取、培养及鉴定采用改良的von Heimburg等[8]方法提取原代前脂肪细胞:大鼠麻醉后无菌条件下取出肾周脂肪组织垫，仔细剔除肉眼可见的血管和纤维，用2 mg/mL的Ⅰ型胶原酶消化90 min至乳糜状，过滤、离心收集并沉淀细胞用于接种培养。油红O染色鉴定后，取状态稳定的2、3代前脂肪细胞长至70%融合后，加入胰蛋白酶室温下消化后制成细胞悬液，用于实验。大鼠原代前脂肪细胞12 h即贴壁呈类圆形，2 d后呈梭形或多角形，5 d呈漩涡状或鱼群状进入对数期生长。成脂诱导后倒置显微镜下细胞内可见反光颗粒，可被油红O染为橘红色，即可鉴定提取的细胞为前脂肪细胞。

1.5前脂肪细胞存活率的测算采用MTT比色法。取对数生长期的前脂肪细胞悬液，按1×104/孔均匀接种于96孔板中, 基础培养基处理24 h后弃除废液，换用无血清DMED/F 12培养液使细胞同步化。药物组浓度梯度为12.5、25、50、100、200、400 mg/L，观察时间点为3、6、12、24 h，并设置不给药物的细胞作为对照组和不含细胞及药物的孔作为空白组，每组6个复孔。实验结束前4 h吸弃旧液，加入含10%的MTT(5 g/L)与无血清DMEM/F 12培养基混合液200 μL，孵育6 h后弃旧液，每孔加入DMSO 150 μL, 振荡器上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。通过分光光度计(492 nm)测定吸光度(A值)，根据公式计算细胞存活率、绘制曲线。存活率=(药物组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)。

1.6脂肪细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6检测提取IH组大鼠前脂肪细胞后分为3组：IH组、LPS组、GBE组，LPS组予以1 μg/mL LPS处理12 h，GBE组予以100 mg/L的GBE处理12 h。实验结束后收集各组上清液，按ELISA试剂盒说明书操作检测各组细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2　结果

2.1各组生理状态比较造模过程中发现IH组大鼠嗜睡，睡眠过程中可闻及类似猫喘声，鼻唇较NC组稍发绀，并可见呼吸暂停，清醒期饮食及活动量减少。IH+GBE组给予GBE期间大鼠生理活动与NC组无明显差异，饮食、活动量正常。

2.2各组不同时间尾动脉血压比较见表1。

表1　各组不同时间尾动脉血压比较±s)

注：与NC组比较，#P<0.05；与IH组比较，△P<0.01。

2.3不同时间不同浓度GBE对前脂肪细胞存活率的影响见表2。

表2　不同时间不同浓度GBE对前脂肪细胞存活率的影响±s)

注：相同作用时间下与0 mg/L GBE比较，*P<0.05；相同药物浓度下，与3 h比较，△P<0.05。

2.4各组TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较见表3。

表3　各组TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

注：与IH组比较，*P<0.01；与LPS组比较，#P<0.01。

3　讨论

脂肪细胞分泌的瘦素、TNF-α、IL-1等多种生物活性物质参与了机体正常的生命活动，缺氧可以刺激脂肪细胞因子的过度表达，引起血管内皮损伤、胰岛素抵抗、炎症反应等[9,10]。OSAS疾病进展中肥胖、缺氧、高血压三者互相作用形成恶性循环[11]，使临床治疗收效欠佳。有数据表明，高血压患者中OSAS的发生率可达50%以上，而有30%的OSAS患者同时合并高血压。因此，抑制脂肪细胞炎性物质的过度分泌是治疗OSAS引起高血压的重要途径之一。

GBE主要有效成分是黄酮和萜类内酯，黄酮类可以清除自由基、抗脂质过氧化，萜类内酯与丝裂原活化蛋白激酶可以抑制炎症反应[12]。赵外欧等[13]研究发现，GBE可以通过NF-κB信号通路抑制缺氧引起的血管内皮细胞损伤。Eckert等[14]研究发现，黄酮、银杏内酯可以降低阿尔茨海默病的氧化应激反应。以上研究均提示,GBE可减轻氧化性损伤。本研究发现,OSAS动物模型给予GBE治疗可以明显降低高血压的发生，在细胞水平给予GBE可以提高前脂肪细胞存活率，且呈剂量、时间依赖性；可显著抑制脂肪细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。提示GBE对OSAS引起的高血压有一定的治疗作用，这可能是与抑制脂肪细胞的炎性因子分泌有关。

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Effect of Ginkgo biloba extract on OSAS rats with secondary hypertension

LIYanhong1,CHENMeixi

( 1GuilinMedicalUniversity,Guilin541001,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) on the obstructive sleep apnea hypoxia syndrome (OSAS) rats with secondary hypertension. MethodsThe intermittent hypoxia (IH) rat models were established. Thirty Wistar rats were randomly divided into the normal oxygen group (NC group), IH group and GBE treatment group (IH+GBE group). We recorded the changes of blood pressure and physiological statement on week 3, 6 and 9. After 9 weeks, the preadipocytes near kidney of each group were extracted and identified, MTT was used to detect the cell viability and proliferation rates of rat preadipocytes which were cultured with 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 mg/L GBE for treatment of 3, 6, 12 and 24 hours. The preadipocytes in the IH groups were extracted and then were divided into the hypoxia control group, LPS-stimulated hypoxia group (LPS group) and GBE-treated hypoxia group (GBE group). After 12 hours, the inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in the cell supernatant were detected. Results ① The blood pressure of the IH group was gradually increased with the time of hypoxia as compared with that of the NC group (P<0.05 orP<0.01), and the blood pressure in the IH+GBE group maintained normal with the prolonged time of hypoxia. ② GBE could promote adipocyte′s growth with a dose-time relationship (allP<0.05). ③ The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the LSP group were significantly higher, but those were significantly lower in the GBE group (allP<0.01).ConclusionGBE has therapeutical effect on OSAS-induced hypertension, which may be achieved by promoting the proliferation of preadipocytes, inhibiting the levels of adipocytes and improving the degree of OSAS inflammation.

obstructive sleep apnea syndrome; hypertension; Ginkgo biloba extract; adipocyte; inflammatory factor

国家自然科学基金项目(81060009);广西卫生厅重点科研项目(重 2010047);广西自然科学基金项目(2013jjAA40386)。

李艳红(1989-)，女，硕士，主要从事呼吸睡眠研究。E-mail:591952247@qq.com

简介：陈梅晞(1962-)，女，副主任医师，教授，主要从事睡眠呼吸疾病和慢性阻塞性肺疾病诊治。E-mail:chenmx@glmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.17.005

R562

A

1002-266X(2016)17-0016-03

2016-01-04)