人支气管上皮细胞体外传代培养方法*

段定山　马　萍　陈　瑶



【实验研究】

人支气管上皮细胞体外传代培养方法*

段定山1马萍2△陈瑶3

目的探讨一种对人支气管上皮细胞株(16HBE)进行体外培养及传代的新方法。 方法用89%1640培养液+10%FBS(胎牛血清)+1%双抗对16HBE进行培养；待细胞贴壁后用0.25%胰酶进行消化传代。 结果16HBE生长良好，贴壁率达80%以上，传代后呈铺路石样镶嵌。 讨论用89%1640培养液+10%FBS+1%双抗及0.25%胰酶可成功对16HBE进行传代培养。

人支气管上皮细胞；培养；传代；参苏饮

随着人类呼吸道疾病研究的不断深入发展，对呼吸道细胞功能的研究也越来越深入。由于HBE是呼吸系统抗感染的主要屏障，作为呼吸道上皮主要组成部分之一的HBE的来源成为课题和研究需要解决的首要问题之一。课题组前期做了益气解表法(参苏饮)对气虚外感大鼠基本生存情况及肺组织相关炎症细胞因子以及 TLR4、 NF-κB、 BD-2 表达影响的相关研究，但由于大鼠跟人类在结构功能上尚存在一定的差异，因此仍需要能直接反映人类呼吸道自身对益气解表法(参苏饮)敏感性的实验，基于伦理学和人道主义以及其他道德约束，课题组不可能在患者身上直接进行研究，而体外培养的16HBE与体内原组织在形态结构以及功能活动上具有极大的相似性，能极大满足课题需要。吴其标等研究发现应用含体积分数20%FBS的DMEM/F12培养基能实现对16HBE较好的传代培养[1]。然而既往大量实验认为过多的FBS会影响细胞的生长，因此作者拟采用1640加少量FBS的方法进行培养传代。

1　实验材料与方法

1.1实验材料准备

1.1.1实验细胞人支气管上皮细胞株(16HBE)购于基尔顿生物科技(上海)有限公司。

1.1.2主要仪器设备/试剂见表1。

表1　主要仪器设备/试剂

1.1.3实验用细胞培养液及冻存液配置方法完全培养液：89%1640培养液+10%FBS+1%双抗(青霉素—链霉素)，4℃短期储存；细胞冻存液：90%FBS+10%DMSO，即用即配。

1.2实验步骤

1.2.1细胞培养收到细胞后首先观察培养液颜色及透明度，于倒置显微镜下观察细胞生长及贴壁情况、融合率以及细胞形态结构：肉眼观察培养液为橙红色，清澈透明；倒置显微镜下可见细胞呈单层贴壁生长，融合率约为60%，形态不规则，有长须状触角(纤毛)伸出，细胞核大，核仁明显，可见细胞分裂相(见封底图1)。根据细胞生长情况弃去一半旧培养液，添加3ml左右的完全培养液。换液后，把培养瓶盖稍微拧松半圈，并放置于细胞培养箱中，37℃、5%CO2条件下进行适应性培养。次日，用倒置显微镜观察细胞生长情况，并更换全部培养液。培养两天后，细胞融合率达80%以上(见封底图2)。当细胞的贴壁融合率达80%以上后，进行消化传代。

1.2.2细胞消化传代直接倾倒法弃尽旧培养液，PBS液漂洗细胞2次，每次用液约2ml。漂洗时轻轻晃动PBS使其漂洗充分。吸尽PBS后，每瓶加入1ml 0.25%胰酶消化液(含0.02%EDTA)，轻轻晃动使其均匀地覆盖于细胞表面。拧紧培养瓶盖，立即置于37℃孵箱，轻轻晃动后静置1min左右。取出后于倒置显微镜下观察消化情况。当细胞间连接松散、细胞质开始回缩、形态变圆、有单个或成片细胞浮起现象时立即加入3ml～4ml完全培养液终止消化。若仍有少量细胞贴附于培养瓶壁，可轻晃培养液、轻敲培养瓶侧壁或用加样枪轻轻吹打培养瓶底部收集所有细胞。尽量将全部细胞悬液用加样枪吸入10ml离心管中，拧紧离心管盖并以离心机转速1000r/min离心5min。离心后弃尽上清液，加入适量完全培养液，轻轻吹打混匀细胞团块，将细胞悬液分装至2～3个培养瓶中。添加完全培养液至每瓶5ml左右，轻轻混匀，于显微镜下观察细胞接种密度。后将培养瓶盖稍拧松，置于孵箱中，轻轻晃动使细胞悬液呈均匀分布，于37℃，5%CO2条件下进行培养。培养过程中分别于0h、12h、1～2d、2～3d、3～5d时间点作好镜下图片记录。

1.2.3细胞冻存当细胞融合到80%以上时，按1.2.2所述方法消化收集细胞。加入适量细胞冻存液，轻轻摇晃使细胞均匀融入冻存液中。用1ml管使每瓶细胞分别对应冻存。封口标记后梯度降温冻存：4℃(20～30min)；用棉花包裹后置-80℃冰箱过夜；次日将冻存管缓慢放入液氮罐中，以便长期储存。

1.3实验中注意事项

1.3.1在细胞培养过程中，应每天观察培养液的颜色和透明度，以判定细胞是否正常生长和培养液内营养物质的消耗情况以及有无污染。并在倒置显微镜下用低倍镜(×100)观察细胞的增殖与融合情况，然后用高倍镜(×400)仔细观察细胞形态并做好记录。根据细胞接种密度与生长情况，一般隔天换一次液以保证细胞生长和新陈代谢所需。

1.3.2消化过程中，需充分洗尽含血清的培养液，加入消化液后，需将培养瓶放入37℃培养箱中促进消化。消化时间应控制在2min以内，时间过长易导致后期培养时细胞生长状况变差。

1.3.3细胞冻存是实验中的关键环节研究表明16HBE较为娇弱，必须严格控制冻存的温度、时间等条件。本实验选用的冻存液为90%FBS加10%DMSO，既能为细胞提供充足的营养条件，又能防止温度骤降形成冰晶造成的伤害。在冻存时，可先将冻存管放入4℃冰箱静置半小时以内，或直接用棉花包裹冻存管直接放入-80℃冰箱；-80℃过夜后再移入液氮罐此种方法可长期储存细胞。-80℃适用于短期储存细胞，一周内细胞活性尚可，复苏存活率可达80%。

1.3.4在整个实验过程中，一定要始终注意“有菌观念，无菌操作”，尤其在使用胰酶消化液过程中应尽量避免消化液被细菌污染。

2　实验结果

传代后3～4h时，细胞开始出现贴壁现象；12h内几乎全部贴壁并开始出现分裂相；1～2天内分裂呈团簇状或开始有拉网现象，接着连接成片状(见封底图3)；最后呈铺路石样镶嵌满整个视野。传代过程中细胞的长触角逐渐消失，呈多边形态(见封底图4～8)。实验发现细胞的融合快慢依接种密度不同而异，按课题需要将细胞进行1传2～4，融合率达80%以上需3～5天。

3　实验结论

选用89%1640培养液+10%FBS+1%双抗成功培养了16HBE，为后续实验做足准备。实验表明，RPMI1640培养液加10%FBS能为其提供较好的生长环境。16HBE贴壁较为牢固，实验中选用的消化液为0.25%胰酶(含0.02%EDTA)，消化能力较强，能较好辅助完成传代培养。

4　讨论

随着呼吸道疾病相关研究的不断发展，能直观反映人体呼吸道抗微生物或免疫功能的细胞研究将会是未来科研的一大走向。秦晓群等研究认为人气道上皮的结构完整性缺陷或功能紊乱是哮喘和慢性阻塞性肺疾病等气道高反应性疾病的启动环节[2]。张志红等研究发现PM2.5能对支气管上皮细胞造成氧化损伤，并可能通过氧化应激调节上皮细胞JAK/STAT信号通路和相关细胞因子的产生[3]。既往认为血清会抑制体外培养的HBE的生长，国内外亦多采用无血清培养基对其进行培养[4、5]，而实验则采用了89%1640培养液+10%FBS的方法，同样成功实现了极好的传代培养效果。由于经费及人力的不足，本实验除了对16HBE细胞进行外观和数量的观察外，还缺少对相关指标的检测和对比。

[1]吴其标，卢金福，尹耀庭，等.人支气管上皮细胞的体外培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2011, 15(50)：9331-9334.

[2]秦晓群，向阳，刘持,等.支气管上皮细胞在气道高反应中的作用[J]. 生理学报, 2007，59(4):454-464.

[3]徐贞贞，张志红，马晓燕,等. PM2.5通过氧化应激对人支气管上皮细胞JAK/STAT信号通路的影响[J].卫生研究，2015,44(3)：451-455

[4]唐隽,马玲国,何发尧,等.气管黏膜上皮细胞无血清培养的初步实验研究.[J].山东大学耳鼻喉眼学报,2005,19(6):403-406.

[5]Paquette JS, Tremblay P, Bernier V, et al. Production of tissue-engineered three-dimensional human bronchial models In Vitro Cell Dev Biol Anim[J].Vitro Cellular & Developmental Biology Animal,2003,39(5-6):213-220.

Method for Subculture of Human Bronchial Epithelial Cell 16HBE in Vitro Condition

DUAN Dingshan1MA Ping2CHEN Yao3

(1.Department of Internal Medicine of TCM, Chengdu Qingbaijiang District Hospital of TCM, Sichuan, Chengdu 610300, China;2.Department of Microbiology and Immunology, School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan, Chengdu 610001, China; 3.Grade 2014 Graduate, School of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610001, China)

ObjectiveTo discuss a new method on subculture 16HBE cell in vitro condition. Methods16HBE were cultured in 89% 1640 nutrient solution add 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% double antibody and cultured with trypsin enzyme-digesting technique and passaged in vitro. Results16HBE grown well and reached an adhesive rate of 80%, mosaicked like paving stone after passage. Conclusions89% 1640 nutrient solution add 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% double antibody and trypsin enzyme-digesting technique can successfully culture and passage 16HBE.

16HBE; Culture; Passage; Shensu decoction

国家自然科学基金资助项目(No.81173365)

1.四川省成都市青白江区中医医院中医内科(成都 610300)；2.成都中医药大学基础医学院病原微生物及免疫学教研室(成都 610001)；3.成都中医药大学基础医学院硕士研究生2014级(成都 610001)

△

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.15.021

1003-8914(2016)-15-2186-03

(本文校对：刘莉2015-11-16)