M i c roRN A-599对静脉曲张中血管平滑肌细胞去分化的影响及其机制研究

赵松峰，胡灵，杜丽苹

（郑州大学附属洛阳中心医院 血管外科，河南 洛阳 471009）

论著

M i c roRN A-599对静脉曲张中血管平滑肌细胞去分化的影响及其机制研究

赵松峰，胡灵，杜丽苹

（郑州大学附属洛阳中心医院 血管外科，河南 洛阳 471009）

目的研究m i c ro R NA-599（m i R-599）在曲张静脉中的表达，探讨m i R-599是否通过下调血小板源性生长因子B（P D G F-BB），抑制曲张静脉中血管平滑肌细胞（V S MC s）去分化。方法收集大隐静脉移植术患者中曲张静脉和正常静脉标本，通过实时荧光定量聚合酶链反应（q R T-P C R）检测42例曲张静脉组织及39例正常静脉组织中m i R-599、m i R-200、m i R-145、m i R-146b、m i R-155的表达；W e s t e r n blot检测两组标本中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H、O P N的表达；在细胞实验中，转染m i R-599m i m i c和m i R-N C至离体培养的V S MC s中，W e s t e r n blot检测V S MC s中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H、O P N、P D G F-BB的表达，噻唑蓝法测细胞增殖、划痕实验观察细胞迁移，利用荧光素酶试验验证P D G F是m i R-599的靶基因。结果相比于正常静脉组织，m i R-599在曲张静脉中的表达降低（F=73.012，P=0.001）。两组m i R-146b、m i R-200、m i R-30、m i R-155的表达量比较，差异无统计学意义。相比于正常静脉组织，曲张静脉组织中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H的表达降低（P＜0.05），O P N的表达升高（F=56.414，P=0.009）；在细胞实验中，相比于对照组，m i R-599组V S MC s中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H的表达升高（P＜0.05），O P N的表达降低（F=27.353，P=0.022），细胞增殖减少（F= 37.824，P=0.016），迁移减少（F=69.365，P=0.001），P D G F表达量减少（F=55.345，P=0.004）。荧光素酶试验结果显示，m i R-599能够降低P D G F-3'-U T R质粒的荧光素活性（F=21.429，P=0.036）。结论在曲张静脉组织中，m i R-599低表达。在V S MC s中，m i R-599可以通过下调P D G F-BB而抑制V S MC s去分化。

下肢静脉曲张；m i c ro R NA-599；血管平滑肌细胞；细胞分化

下肢静脉曲张是指下肢浅静脉系统过分迂曲、伸长和扩张，一般发生在大隐静脉，是血管外科常见病之一，其发病机制尚不清楚［1-2］。相关文献报道显示，静脉曲张的病理生理基础为血管重塑，其中血管平滑肌细胞（v asc u lar smooth m u scle cells，V S MC s）去分化在血管重塑过程中发挥重要作用［3-6］。

M icro R N A（以下简称mi R）是一类长度为18～25个核苷酸的普遍存在于细胞中的非编码R N A。mi R为单链R N A分子，来源于内源转录本，主要作用于靶基因3'非翻译区（3’-u ntranslated re g ions，3’U T R），引起靶m R N A的降解或抑制其翻译，从而调节靶基因的表达［7］。研究证实，mi R还可以通过与靶基因的5’-U T R或开放读框序列结合发挥同样的作用［8］。大量研究所证实，mi R在血管平滑肌细胞去分化中具有重要的调控作用，其中以mi R-599、mi R-200、mi R N A-145、mi R-146b、mi R-155的研究最为热门［9-12］。但是上述5个mi R在静脉曲张中的作用尚未阐明。

血小板源性生长因子B（platelet deri v ed g ro w th f actor-BB，P D G F-BB）是目前公认的，可以诱导V S CM s表型转化的一种生长因子［13］。M A R T I N［14-15］和W A G NE R等［16］的研究发现，瑞舒伐他汀可以通过抑制P D G F-BB的表达从而抑制V S MC s的表型转化。

本实验拟通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time q u antitati v e polymerase chain reaction，q R TPC R）检测静脉曲张组织及对应正常静脉组织中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表达，筛选出与静脉曲张相关的mi R N A，并通过细胞离体实验进一步验证mi R-599是否可以抑制V S MC s去分化及其作用机制是否为通过下调P D G F-BB。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2012年8月-2015年6月在郑州大学附属洛阳中心医院行大隐静脉移植术患者曲张静脉（42例）和正常静脉标本（39例）。其中，男性23例，女性19例；年龄45～76岁，平均（54.0±5.6）岁，样品采集后立即置入-80℃冰箱冷冻保存，并经病理诊断证实。本研究中患者均签署知情同意书，并由郑州大学附属洛阳中心医院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1实验试剂人血管平滑肌细胞T/G H A-V S MC（上海钰博生物科技有限公司），达尔伯克必需基本培养基 （d u lbecco's minim u messential medi u m，D M E M）胰蛋白酶（美国S i g ma公司），胎牛血清（美国G ibco公司），R N A提取试剂（美国I n v itro g en公司），Ta K a R a逆转录试剂盒（大连宝生生物工程有限公司），限制性内切酶B am HⅠ、X hoⅠ、T4 DN A连接酶，无内毒素质粒小、大提取试剂盒，S YB R G reen荧光染料试剂盒（瑞士R oche公司），脂质体2000（上海英骏公司），4，6-联脒-2-苯基吲哚（瑞士R cohe公司），噻唑蓝［3-（4，5-dimethyl-2-thia z olyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra z oli u m bromide，M TT］（美国 Em resco公司），兔或鼠抗人S M-actin、S M-22、S M-MC H、O P N、P D G F-BB、肌动蛋白β多克隆抗体（英国A b cam公司），辣根过氧化酶标记的山羊抗兔或者抗鼠二抗、异硫氰酸荧光素（f l u orescein isothiocyanate，F I T C）、红色异硫氰酸荧光素（red f l u orescein isothiocyanate，F R I T C）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（美国J ac k son公司），W estern blot检测相关试剂（江苏碧云天生物技术研究所）。

1.2.2q R T-P C R反应检测基因表达提取曲张静脉和正常静脉组织中总R N A，将提取的R N A进行逆转录成cDN A，反应体系为20μl，反应条件为：16℃预变性30min，45℃变性30min，85℃退火5min。运用S YB R G reen法检测mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表达，反应条件为：94℃预变性15 min，94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，72℃继续延伸8min。每组样品重复3次，实验重复3次，统计分析曲张静脉和正常静脉组织中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表达。其次，在质粒转染后将V S MC s分成空白对照组、过表达mi R-599组和无效处理组3组，提取总R N A，反转录cDN A，用S YB R G reen法，用 A B I P R I S M 7500自动荧光 PC R仪进行q R T-PC R反应检查mi R-599m R N A表达水平，每组样品重复3次，实验重复3次，设定阈值，测定平均的C t值。

1.2.3W e s t e r n blot检测蛋白表达量提取曲张静脉和正常静脉组织中总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，B C A）法定量蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳胶每孔加入30μl样品，70 V 30min进行蛋白浓聚，110 V 2 h进行凝胶电泳，并用孔径0.45μm聚偏氟乙烯膜250m A 100min进行转膜。转膜后经常温下三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（tris b uff ered saline and t w een 20，T B S T）洗膜3次、封闭1 h后，以1∶1 000浓度加入兔（鼠）抗人S M-actin一抗（或抗S M-22、S M-M H C、O P N、P D G F-BB、肌动蛋白β一抗），4℃孵育过夜，常温下T B S T洗膜3次，辣根过氧化物酶标记羊抗兔（鼠）二抗孵育后增强化学发光法（enhanced chemil u minescence，E C L）检测。柯达胶片暗室显影，Q u antity one软件分析。其次，在质粒转染后将V S MC s分成空白对照组、过表达mi R-599组和无效处理组3组，提取总蛋白，检测各组中S M-actin、S M-22、S M-M H C、O P N、P D G F-BB、肌动蛋白β的表达。

1.2.4转染细胞株mi R-599-mimic由上海吉玛公司设计合成，mi R-599-mimic序列为，正向引物：5'-G UU G U G U C A G UUUVU C AAA C-3'，反向引物：5'-G U UU G A U AAA C U G A C A C AA C-3'。对照序列为，正向引物：5'-G UU G U G U C A G A UUVU C AA U C-3'，反向引物：5'-G A UU G A U AA U C U G A C A C AA C-3'将V S MC细胞接种至6孔板，生长至50%～70%密度时，以脂质体2 000分别转染mi R-599 mimic或mimic-对照各100 pmol 24 h后，提取总R N A后PC R鉴定转染效率，进行后续实验。

1.2.5M TT法测V S MC s增殖在质粒转染后将V S MC s分成空白对照组、过表达mi R-599组和无效处理组3组，每组设3个复孔，2个不加细胞的空白孔。细胞在各自条件下培养24、48和72 h。培养结束后，每孔加入M TT液20μl，37℃下继续孵育4～6 h，小心弃去培养上清液，每孔加入150μl改良Ea g le培养基溶液，震荡10min，选择492 nm波长在酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值并记录。以时间为横轴，吸光值为纵轴绘制各组V S MC s细胞生长曲线。

1.2.6细胞划痕实验测V S MC s迁移在质粒转染后将V S MC s分成空白对照组、过表达mi R-599组和无效处理组3组。1.8mmol/L羟基脲作用12 h抑制细胞增殖，100μl黄色枪头垂直孔板制造细胞划痕，吸掉细胞培养液，磷酸盐缓冲溶液（phosphate b uff er saline，P B S）冲洗孔板3次。在相应的培养条件下培养细胞，拍照记录0、12、24、48和72 h图片，用I ma g e pro pl u s 6.0软件分析计算细胞迁移面积，并以迁移面积和原划痕面积比值来表示各组V S MC s迁移的多少。

1.2.7细胞免疫荧光法检测各组中S M-a c t in在细胞中的分布及表达在质粒转染后将V S MC s分成空白对照组、过表达mi R-599组和无效处理组3组。P B S洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25%Triton X 100穿破细胞膜，山羊血清室温封闭1 h，加入稀释250倍的anti-S M A抗体，4℃过夜，P B S清洗3遍，加入结合有异硫氰酸荧光素的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，P B S清洗3遍，荧光显微镜拍照后图片用I ma g e pro pl u s 6.0分析。

1.2.8荧光素酶试验设计合成P D G F-BB-3'-U T R的序列及突变序列，以P D G F-BB质粒为载体，分别构建能够表达荧光素酶的包含P D G F-BB-3'-U T R 和P D G F-BB-3'-U T R突变序列的质粒，然后将V S MC s按每孔1×105接种至24孔板，24 h后以脂质体2 000共转染200 n g包含P D G F-BB-3'-U T R 或P D G F-BB-3'-U T R突变序列的荧光素酶质粒和80 n g海肾荧光质粒，以及60 pmol mi R-599-mimic或对照，48 h后用荧光检测仪检测荧光强度，海肾荧光作为内参照，每组实验重复3次。

1.3统计学方法

采用S P SS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较用单因素方差分析，两两比较用LS D法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1V SMC去分化相关的m i RN A s和蛋白质在曲张静脉和正常静脉组织中的表达

q R T-PC R反应检测曲张静脉和正常静脉组织中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表达，结果发现，曲张静脉组织中mi R-599的表达低于正常静脉组织（F=73.012，P=0.001）（见图1A）。两组m i R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表达量比较，差异无统计学意义。W estern blot检测曲张静脉和正常静脉组织中S M-actin、S M-22、S M-MC H、O P N的表达，相比对正常静脉组织，曲张静脉组织中S M-22、S M-MC H表达减少，O P N表达增多（F=56.414，P=0.009）；两组S M-actin表达比较，差异无统计学意义（见图1B）。

2.2m i R-599对V SMCs增殖和迁移的影响

mi R-599minic转染V S MC s后，R eal-time q PC R反应检测发现，过表达mi R-599组中mi R-599的表达较对照组和空质粒升高（F=65.753，P=0.001）（见图2A）。12 h时3组V S MC s的增殖比较，差异无统计学意义；干预24 h后，相比于对照组和空质粒组，mi R-599组中V S MC s增殖减少（F=37.824，P=0.0161）（见图2B）。干预48 h后，相比于对照组和空质粒组，mi R-599组中V S MC s迁移减少，差异有统计学意义（F=69.365，P=0.001）（见图2C）。

2.3m i R-599对V SMCs中SM-a c t i n、SM-22、SM-MC H、OPN、PD GF-BB表达的影响

图1　曲张静脉和正常静脉组织中V SMC去分化相关的m i RN A s以及蛋白质表达

图2　M i R-599抑制V SMCs的增殖和迁移

mi R-599mimic转染V S MC s后，W estern blot检测发现，相比于对照组和空质粒组，mi R-599组V S MC s中S M-22、S M-M H C表达增多，O P N表达减少（F=27.353，P=0.022）。3组S M-actin表达比较，差异无统计学意义。见图3。

2.4m i R-599对V SMCs形态的影响

M i R-599mimic转染V S MC s后，免疫荧光结果显示，mi R-599组V S MC s形态细长，呈典型的血管平滑肌细胞形态，对照组和空质粒组中平滑肌细变圆变宽，失去原有的细胞形态。见图4。

2.5m i R-599通过识别3'-UTR抑制PD GF-BB的表达

分别构建包含P D G F-BB-3'-U T R和其突变序列的荧光素酶质粒（见图5A），与mi R-599-mimic对照共转V S MC s细胞，培养24 h后，检测各组细胞荧光素酶活性，结果显示，mi R-599-mimic+W T-P D G FBB-3'-U T R组荧光素酶活性低于空质粒+W TP D G F-BB-3'-U T R组（F=21.429，P=0.036）（见图5B）。W estern blot检测结果显示，相比于对照组和空质粒组，mi R-599组V S MC s中P D G F-BB表达降低（F= 55.345，P=0.004）（见图5C）。

图3　M i R-599对V SMCs中细胞分化状态标志蛋白表达的影响

图4　细胞免疫荧光法观察各组的细胞形态 （×200）

图5　m i R-599通过识别3'-UTR抑制PD GF-BB的表达

3　讨论

在不同的外界因素影响下，V S MC s处于不同的分化状态，具有很强的可塑性。在正常血管膜中的V S MC s是一种高分化的细胞，细胞形态呈梭形，主要起维持血管形状和收缩血管的作用，具有低增殖、低迁移、低蛋白分泌等特征［17-18］。当发生动脉粥样硬化、静脉扩张、动脉瘤等血管疾病时，V S MC s可以去分化为未分化成熟的细胞，形态变圆，细胞收缩性能下降，表现出高增殖、高迁移、高蛋白分泌等特征［19-22］。

静脉曲张时静脉管腔明显扩张，局部管壁厚薄不均，管壁硬度增加而顺应性减低，目前认为血管重塑是静脉曲张的基本病理生理过程［23］。V S MC s去分化作为血管重塑的关键和始动环节，在静脉曲张的发生、发展发挥重要的调节作用。J I A N G等［21］发现在静脉曲张发生时，位于静脉管壁的收缩型V S MC s去分化为合成型细胞。本实验结果显示，静脉曲张组织中S M-22、S M-MC H等V S MC s分化状态标志性蛋白表达减少，而合成型细胞标志蛋白O P N表达增多，同样证实静脉曲张的病理机制中有V S MC s去分化的参与。

mi R是一类进化上高度保守的非编码小分子单链R N A，越来越多的证据显示，mi R参与对细胞增殖、迁移和细胞表型的调控［24］。目前经证实的与V S MC s去分化相关的mi R主要包括：mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155、mi R-146a、mi R-133、mi R-221、mi R-222、mi R-21和mi R-143［13］。在大鼠V S MC s离体实验中，mi R-143和mi R-145表达量较高，加入P D G F-BB后，这两种mi R表达量骤减。在用球囊损伤血管后，mi R-143和mi R-145基因敲除的小鼠V S MC s分化受阻，说明上述mi R在血管损伤后的修复过程中发挥重要作用［25］。C H EN G等［26］的实验进一步探明mi R-145是通过抑制K L F5的表达，从而减少球囊损伤后血管中V S MC s的增殖和迁移。最近X I E等［9］的研究在细胞和动物两个层面证实mi R-599是通过靶向结合T G F-βⅡ受体基因，从而抑制V S MC s的增殖。本实验结果显示，mi R-599在静脉曲张组织中表达减少，并进一步在离体实验中证实mi R-599可以抑制V S MC s的增殖、迁移及去分化。

P D G F-BB是最早发现的一种可以促进V S MC s去分化的因素，是一种较强的促有丝分裂因子，具有促增殖和迁移的生物活性，能引起V S MC s的合成及分泌功能增强［27］。P D G F-BB通过诱导特定DN A的表达或沉默，最终导致V S MC s去分化。分化成熟的V S MC合成和分泌P D G F-BB的能力很弱。目前已知P D G F-BB主要通过M KK6/p38和M A P K M E K1/E R K两条途径发挥促V S MC s去分化的作用［28］。笔者用荧光素酶实验进一步发现，mi R-599是通过与P D G FBB-3'-U T R靶向结合，减少P D G F-BB的表达，从而发挥其抑制V S MC s去分化的作用。

本实验通过q R T-PC R反应检测静脉曲张组织及正常静脉组织中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表达，发现mi R-599在静脉曲张组织中表达减少，同时发现静脉曲张组织中P D G F-BB的表达增加，V S MC s分化表型的标志性蛋白表达减少。在离体实验中证实mi R-599可以抑制V S MC s增殖、迁移、去分化，并进一步通过萤光素酶实验发现其机制是通过靶向抑制P D G F-BB的表达，为阐明静脉曲张的发病机制提供新的思路。

［1］H A M D A N A，L I V I N G S T O N E H，L Y N M C.J A M A patient pa g e. treatment o f v aricose v eins［J］.J ama，2013，309（12）:1306.

［2］田庆刚，刘瑞，张生彬.大隐静脉曲张腔内激光治疗与传统手术的对比研究［J］.中国现代医学杂志，2012，1:77-79.

［3］X I A O Y，HU A N G Z，Y I N H，et al.Desm u slin g ene k noc k do w n ca u ses altered e x pression o f phenotype mar k ers and di ff erentiation o f sapheno u s v ein smooth m u scle cells［J］.JV asc Su r g，2010，52（3）: 684-690.

［4］P F I S TE R E R L，M E Y E R R，F E L DNE R A，et al.B orte z omib protects f rom v aricose-li k e v eno u s remodelin g［J］.F aseb J，2014，28（8）: 3518-3527.

［5］J I A N G H，L U N Y，WU X，et al.A ssociation bet w een the hypomethylation o f osteopontin and inte g rin beta3 promoters and v asc u lar smooth m u scle cell phenotype s w itchin g in g reat sapheno u s v aricose v eins［J］.I nt J M ol S ci，2014，15（10）:18747-18761.

［6］HU A N G X，J I N Y，Z HOU D，et al.I Q G A P1 promotes the phenotypic s w itch o f v asc u lar smooth m u scle by myocardin path w ay: a potential tar g et f or v aricose v ein［J］.I nt J C lin E x p P athol，2014，7（10）:6475-6485.

［7］I W A K A W A H O，T O M A R I Y.The F u nctions o f micro R N A s: m R N Adecay and translational repression［J］.Trends C ell B iol，2015，25（11）:651-665.

［8］L Y T L E J R，Y A R I O T A，S TE I T Z J A.Tar g et m R N A s are repressed as e ff iciently by micro R N A-bindin g sites in the 5'U T R as in the 3'-U T R［J］.P roc Natl A cad S ci U S A，2007，104（23）: 9667-9672.

［9］X I E B，Z H A N G C，K A N G K，et al.M i R-599 inhibits v asc u lar smoothm u sclecellsproli f erationandmi g rationbytar g etin g T G F-B2［J］.P L o S O ne，2015，10（11）:D O I:10.1371/j o u rnal.pone. 0141512.

［10］Z H EN G B，B E R N I E R M，Z H A N G X H，et al.M i R-200c-S U M O ylated K L F4 f eedbac k loop acts as a s w itch in transcriptional pro g rams that control V S MC proli f eration［J］.J M ol C ell C ardiol，2015，82:201-212.

［11］W A N G H，J I A N G M，X U Z，et al.M i R-146b-5p promotes V S MCproli f eration and mi g ration［J］.I nt J C lin E x p P athol，2015，8（10）:12901-12907.

［12］C S A K T，B A L A S，L IPP A I D，et al.M icro R N A-155 de f iciency atten u ates li v er steatosis and f ibrosis w itho u t red u cin g in f lammation in a mo u se model o f steatohepatitis［J］.P L o S O ne，2015，10（6）: D O I:10.1371/j o u rnal.pone.0129251.

［13］L I P，Z HU N，Y I B，et al.M icro R N A-663 re g u lates h u man v asc u lar smoothm u scle cell phenotypic s w itchandv asc u lar neointimal f ormation［J］.C irc R es，2013，113（10）:1117-1127.

［14］M A R T I N K A，M E R EN IC K B L，D I N G M，et al.R apamycin promotes v asc u lar smooth m u scle cell di ff erentiation thro u g h ins u linreceptors u bstrate-1/phosphatidylinositol3-k inase/A k t2 f eedbac k si g nalin g［J］.JB iol C hem，2007，282（49）:36112-36120.

［15］M A R T I N K A，RZ U CI D L O E M，M E R EN IC K B L，et al.The mT O R/p70 S6K1 path w ay re g u lates v asc u lar smooth m u scle cell di ff erentiation［J］.A m J P hysiol C ell P hysiol，2004，286（3）:507-517.

［16］W A G NE R R J，M A R T I N K A，P OW E LL R J，et al.L o v astatin ind u ces V S MCdi ff erentiation thro u g h inhibition o f R heb and mT O R［J］.A m J P hysiol C ell P hysiol，2010，299（1）:119-127.

［17］魏兵，刘亚丽，张超，等.神经激肽-1受体拮抗剂W I N62577对哮喘气道重塑大鼠气管平滑肌细胞迁移的影响［J］.中国当代儿科杂志，2015，11:1248-1252.

［18］季军，潘一峰，何霞，等.超声靶向转染c-myc基因的反义肽核酸抑制兔髂动脉平滑肌细胞增生的实验研究［J］.中国现代医学杂志，2015，2:32-36.

［19］L I U R，L E SL I E K L，M A R T I N K A.Epi g enetic re g u lation o f smooth m u scle cell plasticity［J］.B iochim B iophys A cta，2015，4（1849）:448-453.

［20］C H I S T I A KOV D A，O R E KHOV A N，BOB R Y S H E V Y V.V asc u lar smoothm u scle cell inatherosclerosis［J］.A cta P hysiol （O x f），2015，214（1）:33-50.

［21］J I A N G H，L U N Y，WU X，et al.A ssociation bet w een the H ypomethylation o f osteopontin and inte g rin beta3 promoters and v asc u lar smooth m u scle cell di ff erentiation in g reat sapheno u s v aricose v eins［J］.I nt J M ol S ci，2014，15（10）:18747-18761.

［22］A I L A W A D I G，M O E H L E C W，P E I H，et al.S mooth m u scle phenotypic mod u lation is an early e v ent in aortic ane u rysms［J］. J Thorac C ardio v asc Su r g，2009，138（6）:1392-1399.

［23］PI A ZZ A G.V aricose v eins［J］.C irc u lation，2014，130（7）:582-587.

［24］Z H A O Y，S A M A L E，SR I V A S T A V A D.S er u m response f actor re g u lates a m u scle-speci f ic micro R N A that tar g ets H and2 d u rin g cardio g enesis［J］.Nat u re，2005，436（7048）:214-220.

［25］C O R DE S K R，S H EE HY N T，WH I TE M P，et al.M i R-145 and mi R-143 re g u late smooth m u scle cell f ate and plasticity［J］. Nat u re，2009，460（7256）:705-710.

［26］C H EN G Y，L I U X，Y A N G J，et al.M icro R N A-145，a no v el smooth m u scle cell phenotypic mar k er and mod u lator，controls v asc u lar neointimal lesion f ormation［J］.C irc R es，2009，105（2）: 158-166.

［27］G O M E Z D，OW EN S G K.S mooth m u scle cell phenotypic s w itchin g in atherosclerosis［J］.C ardio v asc R es，2012，95（2）:156-164.

［28］A U S T I N K M，N G UY EN N，J A V I D G，et al.Noncanonical matri xmetalloprotease-1-protease-acti v atedreceptor-1si g nalin g tri gg ers v asc u lar smooth m u scle cell dedi ff erentiation and arterial stenosis［J］.J B iol C hem，2013，288（32）:23105-23115.

（童颖丹 编辑）

M icroRNA-599 inhibits vascular smooth muscle cell dedifferentiation and its mechanism in varicose veins

Song-feng Zhao，Ling Hu，Li-ping Du
（Department of Vascular Surgery，Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang，Henan 471009，China）

Objective To verify whether microRNA-599（miR-599）could inhibit vascular smooth muscle cell（VSMC）dedifferentiation by targeting platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB）in varicose veins. M ethods Varicose veins and normal samples were collected from patients undergoing great saphenous vein transplantation surgery.qRT-PCR was used to test the expressions of miR-599，miR-200，miR-145，miR-146b and miR-155 in the varicose veins.Western blot was used to test the expressions of SM-actin，SM-22，SM-MCH and OPN.For in vitro experiment，after miR-599 was transfected into VSMCs，MTT was used to investigate the proliferation ability of VSMCs，wound healing was employed to test the migratory ability of VSMCs，Western blot was used to investigate the expressions of SM-actin，SM-22，SM-MHC，OPN and PDGF-BB in VSMCs.Luciferase assay was used to confirm whether PDGF-3'-UTR was the target gene of miR-599.Results Compared with the healthy control tissue，the expressions of miR-599，SM-actin，SM-22and SM-MHC in the varicose veins were significantly decreased（P＜0.05）；meanwhile the expression of OPN increased（P＜0.01）.The result of the in vitro experiment showed that compared with the control group，the expressions of SM-actin，SM-22 and SM-MHC were increased in the miR-599 group（P＜0.05），and the expression of OPN and PDGF-BB decreased（P＜0.05）.The luciferase activity of the PDGF-3'-UTR plasmid was suppressed by miR-599（P＜0.05）.Conclusions In varicose veins，the expression of miR-599 decreases. miR-599 inhibits VSMC dedifferentiation by targeting PDGF-3'-UTR.

varicose vein；miR-599；VSMC；dedifferentiation

R 654.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.017

1005-8982（2016）15-0091-07

2016-01-20