缺氧条件下沉默解聚素-金属蛋白酶17基因对人乳腺癌MC F-7细胞增殖的影响*

陈国福，吴丽君，张雪鹏，蔡准，孟祥潮

（华北理工大学附属医院 肿瘤外科，河北 唐山 063000）

论著

缺氧条件下沉默解聚素-金属蛋白酶17基因对人乳腺癌MC F-7细胞增殖的影响*

陈国福，吴丽君，张雪鹏，蔡准，孟祥潮

（华北理工大学附属医院 肿瘤外科，河北 唐山 063000）

目的探讨在缺氧条件下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17（ADA M 17）基因的短发夹R NA（s h R NA）对人乳腺癌MC F-7细胞增殖的作用机制。方法针对ADA M 17基因设计具有特异性ADA M 17-s h R NA，经电穿孔转染MC F-7细胞。依据细胞培养条件（常氧和缺氧）和细胞转染因素（空白P B S、转染无义序列ADA M 17-s h N C、转染ADA M 17-s h R NA），实验分为常氧对照组、常氧s h N C组、常氧s h R NA组、缺氧对照组、缺氧s h N C组和缺氧s h R NA组。通过充入1%氧O2、5%二氧化碳C O2和94%氮N 2的混合气体培养箱模拟缺氧环境，分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（q R T-P C R）、i C ELL ig e n c e系统、流式细胞仪检测MC F-7细胞的ADA M 1基因的表达水平、细胞生长曲线、增殖活性和细胞周期。结果靶向针对ADA M 17基因的ADA M 17-s h R NA在缺氧条件下可以有效沉默人乳腺癌MC F-7细胞ADA M 17基因的表达（缺氧s h R NA组2-△△CT=0.55±0.16）。从而导致MC F-7细胞生长速度减慢，细胞增殖能力降低，细胞周期延缓。结论ADA M 17 s h R NA和缺氧存在协同作用，共同抑制肿瘤细胞的增殖。

解聚素-金属蛋白酶17；乳腺癌；缺氧；增殖；细胞周期

缺氧是恶性实体肿瘤的重要生物学特征之一，缺氧与肿瘤的增殖、侵袭、转移密切相关［1］。缺氧的肿瘤细胞易发生基因突变，对放化疗更加耐受［2］。相关研究已证实，缺氧是乳腺癌等实体肿瘤微环境的基本特征之一［3］。解聚素-金属蛋白酶17（a disinteg rin and metalloproteinases 17，A D A M17）是解聚素-金属蛋白酶家族的重要成员之一，目前，研究发现A D A M17在乳腺癌的发生、发展中起到极其重要的作用。R N A干扰（R N A inter f erence，R N A i）是一种强大的基因沉默技术。课题前期研究发现，利用R N A i技术转染A D A M17 si R N A到乳腺癌MC F-7细胞中，可沉默MC F-7细胞A D A M17基因的表达，抑制其细胞的侵袭、趋向运动能力及增殖能力［4-5］。但关于在缺氧条件下利用R N A i沉默A D A M17基因对人乳腺癌MC F-7细胞增殖的影响研究甚少，本研究旨在揭示缺氧和A D A M17与肿瘤细胞增殖的关系。初步探讨R N A i和缺氧微环境对肿瘤细胞增殖的影响。

1　材料与方法

1.1材料

MC F-7细胞系购于中国医学科学院基础医学研究所细胞库，Tri z ol、M-M L V逆转录试剂盒、PI atim u m S YB R PC R试剂盒均由美国I n v itro g en公司提供，A D A M17 sh R N A和A D A M17 shN C载体购买于上海吉玛制药技术有限公司，每个载体均包含绿色荧光蛋白G F P的表达框架，根据绿色荧光蛋白的表达情况来确定转染效率。靶序列如下：A D A M17靶序列p GP U6/G F P/Neo-homo-A D A M17为5'-GG AA C T C TT GG A TT A GC TT A T-3'，阴性对照无义序列p GP U6/ G F P/Neo-shN C：5'-G TT C T CCG AA CG T GC A CG T-3'。

1.2方法

1.2.1实验分组依据细胞培养条件和细胞转染因素的不同，实验分为6组，见表1。

1.2.2细胞培养将人乳腺癌MC F-7细胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素混合液的D M E M高糖培养基培养。常氧：即常氧下培养，37℃恒温、95%空气、5%二氧化碳C O2、饱和湿度条件下于C O2培养箱内常规培养；缺氧：即缺氧下培养，37℃恒温，注入含1%氧O2、5%C O2、94%氮N2混合气体的赛默Thermo3131水套式培养箱内，饱和湿度下缺氧培养。

表1　实验分组

1.2.3电穿孔法转染收集细胞，每个电击杯中添加1×106个细胞，每个电击杯中添加5μl的A D A M17-sh R N A，加入质粒。充分混匀细胞，上机操作。设置C UY21 ED I TⅡ细胞电转化仪的输出电压（125 V）、脉冲宽度（10ms）和电转时间（1min），电处理结束后，加入完全培养液。同样的方法转染shN C组和对照组，shN C组加入转染试剂和无义序列A D A M17-shN C，对照组加入与转染试剂和A D A M17-sh R N A混合总量等量的 P B S。

1.2.4q R T-P C R检测MC F-7细胞的ADA M 17 mR NA的表达水平成功转染12～24 h后，根据细胞培养条件的不同，分别置入常氧下培养和缺氧下培养24～48 h，按Tri z ol试剂说明书一步法提取总R N A，测定总R N A的纯度和浓度符合实验要求后采用M-M L V试剂盒合成cDN A，P iatim u m S YB R试剂盒进行PC R扩增反应。A D A M17引物序列：上游5'-A T C AAA CCC TTT CC T GCG-3'，下游5'-C AAA CCC A T CC T CG T CC A-3'，扩增片段长度154 bp；β-actin内参引物序列：上游5'-G T C A CC TT C A CCG TT CC A G T TTT-3'，下游5'-TT C TTT CCC A C A TT GCG TT G A TT C-3'，扩增片段长度175 bp。对实验结果采用相对定量的方法进行分析。

1.2.5i C ELL ig e n c e系统检测MC F-7细胞的增殖使用i C E LL i g ence系统进行检测，在E-P late L8孔中加入300μl混合均匀的细胞悬液。将1块 E-P late L8放到水套式培养箱中的i C E LL i g ence上行缺氧培养。另1块放到C O2培养箱中的i C E LL i g ence上行常氧培养。用i C E LL i g ence系统检测，导出实验数据和结果图，传感器检测获得的细胞阻抗参数用细胞指数（CI）来表示，应用i C elli g ence D A S o f t w are 1.0软件进行数据分析和图像处理。

1.2.6流式细胞仪分析细胞周期成功转染12～24 h后，根据细胞培养条件的不同，分别置入常氧和缺氧下培养24 h，收集各组细胞，加入预冷的70%乙醇2ml充分悬浮细胞，置于4℃固定细胞24 h以上。细胞固定好后，加入预冷的P B S液重悬细胞，加入浓度为50μg/ml的PI染液500μl，室温避光染色30min。用300钼滤网过滤细胞悬液，选用标准程序经流式细胞仪检测。经细胞周期软件M od F it分析结果。

1.3统计学方法

采用S P SS 19.0统计软件进行数据分析，用单因素方差分析，进行两个实验因素的各水平全面组合的实验时，用两因素析因设计的方差分析各实验因素的单独效应、主效应和因素的交互效应，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MC F-7细胞成功转染s h RN A表达载体

转染后连续常氧下培养48 h后置于荧光倒置相差显微镜下观察转染效率，本实验中电穿孔转染法的效率高达90%以上（见图1），证实本实验应用的转染方法是成功的。

2.2A D A M 17 m RN A相对表达水平

各组A D A M17 m R N A的相对表达量见表2。根据析因方差分析得出，细胞培养条件对MC F-7细胞A D A M17 m R N A的表达情况有影响；细胞转染因素对MC F-7细胞A D A M17 m R N A的表达情况亦有影响。不同细胞培养条件间差异有统计学意义（F= 17.914，P=0.000）。缺氧条件下培养的MC F-7细胞的A D A M17 m R N A相对表达量低于常氧条件下培养的。不同细胞转染因素之间差异有统计学意义（F= 50.005，P=0.000）。结合多重比较结果分析，无论常氧还是缺氧，转染sh R N A的MC F-7细胞的A D A M17 m R N A的相对表达量低于对照组和shN C组（P＜0.05），对照组和shN C组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3细胞生长曲线和细胞增殖活性

表2　各组细胞的A D A M 17 m RN A的表达情况

图1　荧光倒置相差显微镜下观察转染效率 （×100）

经i C elli g ence D A S o f t w are 1.0软件处理分析后得到细胞生长曲线（见图2A和图2B），并测得常氧对照组、常氧shN C组、常氧sh R N A组、缺氧对照组、缺氧shN C组和缺氧sh R N A组的CI分别为6.22、6.19、3.12、2.86、2.73和1.27。对各组MC F-7细胞进行析因方差分析得出，细胞培养条件对MC F-7细胞的生长速度和增殖活性有影响；细胞转染因素对MC F-7细胞生长速度和增殖活性亦有影响。不同细胞培养条件比较差异有统计学意义（F=5.258，P= 0.000），缺氧培养较常氧培养，各组的MC F-7细胞的生长速度在24 h内加快，24 h后减慢，增殖活性降低；不同细胞转染因素差异有统计学意义（F=11.053，P=0.000），结合多重比较结果，无论常氧还是缺氧，转染sh R N A的MC F-7细胞的生长速度和增殖活性相对于对照组和shN C组降低（P＜0.05），对照组和shN C组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4细胞周期的变化

各组的G0/G1、S、G2/M细胞周期见图3和表3。各组的G0/G1、S、G2/M细胞周期的析因方差分析结果表明，细胞培养条件对MC F-7细胞周期中G0/G1、S、G2/M的情况均有影响；细胞转染因素对MC F-7细胞周期中的G0/G1、S、G2/M亦有影响。不同细胞培养条件比较差异有统计学意义（G0/G1期：F=60.211，P=0.000；S期：F=37.061，P=0.000；G2/M期：F=10.103，P=0.014），缺氧条件下培养的MC F-7细胞的G0/G1期细胞多于常氧条件下培养的，其S、G2/期细胞均少于常氧下培养的；不同细胞转染因素比较差异有统计学意义（G0/G1期：F=95.853，P=0.000；S期：F=31.974，P= 0.000；G2/M期：F=15.089，P=0.001）。结合多重比较结果发现，无论常氧还是缺氧，转染A D A M17-sh R N A 的MC F-7细胞的G0/G1期细胞多于对照组和shN C组（P＜0.05），S期和G2/M期细胞少于对照组和shN C组（P＜0.05），而对照组和shN C组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2　各组细胞的生长曲线

图3　各组的流式细胞周期图

表3　各组的G0/G1、S、G2/M期细胞的百分比比较 （）

表3　各组的G0/G1、S、G2/M期细胞的百分比比较 （）

注：†与常氧对照组比较，P＜0.05

组别G2/ M常氧对照组　5 4 . 3 8 ± 1 . 9 5 　3 3 . 8 0 ± 4 . 0 9 　1 1 . 8 2 ± 2 . 7 0常氧s h N C组　5 3 . 0 3 ± 2 . 5 2 　3 6 . 0 1 ± 1 . 5 5 　1 0 . 9 7 ± 1 . 9 4常氧s h R N A组　7 0 . 1 0 ± 1 . 8 5†　2 3 . 6 0 ± 1 . 0 9†　6 . 3 0 ± 0 . 8 2†缺氧对照组　6 2 . 8 4 ± 2 . 0 9†　2 6 . 1 5 ± 1 . 5 8†　1 1 . 0 2 ± 2 . 3 8缺氧s h N C组　6 2 . 5 7 ± 1 . 1 0†　2 7 . 5 1 ± 1 . 9 8†　9 . 9 2 ± 1 . 9 5缺氧s h R N A组　7 4 . 3 5 ± 2 . 3 6†　2 0 . 9 7 ± 1 . 3 5†　5 . 3 5 ± 0 . 3 8†G0/ G1S

3　讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据文献报道2000～2006年我国女性乳腺癌粗发病率为6.96/10万～71.46/10万，且呈明显上升趋势［6］。目前多采用手术、放化疗和内分泌治疗等综合治疗手段，但效果并不理想。近年来，随着分子生物学技术的提高和对肿瘤发病机制的深入认识，开始针对细胞受体、关键基因和调控分子为靶点的治疗研究，即“靶向治疗”［7］。基因靶向治疗是当前乳腺癌治疗领域研究的热点。

A D A M17是解聚素-金属蛋白酶家族的重要成员之一，具有解聚素和金属蛋白酶的活性，A D A M17发挥蛋白剪切酶样的作用，使得蛋白细胞膜外功能区脱落，激活或释放许多结构和功能不同的分子，从而调节如增殖、运动能力等多种细胞生物学行为［8］。目前研究发现，A D A M17在多种恶性肿瘤组织中呈现高表达，如乳腺癌［9］、脑胶质瘤［10］、头颈部鳞癌［11］、卵巢癌等［12］。R N A i表现为双链R N A，以序列特异性的方式来沉默内源性基因的表达。现大多数si R N A表达载体被设计成能表达短的发夹状R N A（sh R N A），使得sh R N A在细胞内表达，随后被加工成si R N A，从而发挥基因沉默作用。近来提出运用R N A i技术下调A D A M17表达水平，可以逆转乳腺癌细胞的恶性性状［13］，亦可抑制乳腺肿瘤的生长和侵袭能力，本实验研究证实，A D A M17-sh R N A可以有效沉默人乳腺癌MC F-7细胞A D A M17基因的表达，从而降低细胞生长速度，延缓细胞周期，抑制细胞增殖。马雷等［14］采用sh R N A沉默S100A4基因对乳腺癌MC F-7细胞体外增殖和迁移力具有抑制作用。R N A i抑制效果确切，为临床乳腺肿瘤的治疗提供一种有效的新方法。

相关研究已证实，缺氧是乳腺癌等实体肿瘤物理微环境的基本特征之一［3］。随着肿瘤细胞的快速生长，体积增大，其内部血液供应不足，逐渐导致肿瘤内部氧的供应和消耗发生失衡，局部微环境的缺氧可以影响肿瘤细胞的增殖、浸润和转移、凋亡等恶性生物学行为的发生。赵婷婷等［15］发现，缺氧对乳腺癌细胞的生物学行为产生重要影响，尤其是增加乳腺癌细胞迁移、侵袭的能力。张博等［16］发现，缺氧能上调人乳腺癌MC F-7细胞mi R N A-21表达，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。基于以上认识，本研究采用R N A i技术将针对A D A M17基因的sh R N A表达载体转染入乳腺癌MC F-7细胞，通过体外模拟缺氧微环境，旨在观察缺氧条件下沉默A D A M17基因对人乳腺癌MC F-7细胞增殖的影响。研究结果表明，A D A M17-sh R N A在缺氧条件下沉默MC F-7细胞的A D A M17-m R N A的表达，进而导致细胞生长速度减慢，细胞增殖能力降低，降低MC F-7细胞S期、G2/M期的比例，G0/G1期出现明显阻滞，细胞周期延缓。证明细胞培养条件（缺氧条件）和细胞转染因素（转染A D A M17 sh R N A）对MC F-7细胞的A D A M17-m R N A的表达、细胞生长速度和增殖活性、细胞周期均有影响。因此得出，A D A M17-sh R N A和缺氧微环境存在协同作用，共同抑制肿瘤细胞的增殖。在缺氧条件下，A D A M17与乳腺癌发生、发展的关系将为乳腺癌靶向治疗提供一个新的研究方向。有关缺氧与R N A干扰的相互作用机制有待进一步研究，相信对缺氧及R N A i技术的深入研究，将有助于人们解开肿瘤细胞和缺氧微环境之间的关系机制，为肿瘤的基础研究和临床靶向治疗提供新的思路和方法。

［1］R U A N K，S O N G G，OUY A N G G L.R ole o f hypo x ia in the hallmar k s o f h u man cancer［J］.C ell B iochem，2009，107（6）:1053-1062.

［2］B R I S T OW R G，H I LL R P.H ypo x ia and metabolism:hypo x ia，DN A repair and g enetic instability［J］.Nat R e v C ancer，2008，8（3）: 180-192.

［3］S E M EN Z A G L.C ancer-stromal cell interactions mediated by hypo x iaind u ciblef actors promotean g io g enesis，lymphan g io g enesis，andmetastasis［J］.O nco g ene，2013，32（35）:4057-4063.

［4］杨雯靖，张雪鹏，焦桂梅，等.A D A M17-si R N A抑制人MC F-7乳腺癌细胞体外侵袭能力的研究［J］.天津医药，2011，11（21）:1045-1047.

［5］路延芹，赵光明，张雪鹏，等.A D A M17-si R N A对MC F-7人乳腺癌细胞增殖的影响［J］.现代中西医结合杂志，2011，20（24）:3003-3005.

［6］唐志柳，白洁，顾丽娜，等.2000～2010年我国前列腺癌和乳腺癌流行状况的系统性综述［J］.中国肿瘤，2013，22（4）:260-265.

［7］W E S TEE L V，DE PI E RR E A.C ombined modality treatment o f non-small-cell l u n g cancer［J］.A m J R espir M ed，2003，2（6）: 477-490.

［8］B L A C K R A.T u mor necrosis f actor-alpha con v ertin g en z yme［J］. I nt J B iochem C ell B iol，2002，34（1）:1-5.

［9］GI R IC Z O，C A L VO V，P ETE RS O N E A，et al.T A C E-dependent T G F-α sheddin g dri v es triple ne g ati v e breast cancer cell in v asion［J］.I nt J C ancer，2013，133（11）:2587-2595.

［10］呼铁民，孙影.A D A M17和E G F R在脑胶质瘤中的表达及意义［J］.包头医学院学报，2015，31（8）:3-8.

［11］G S C HW I ND A，H A R T S，F I S C H E R O M，et al.T A C E clea v a g e o f proamphire g u linre g u lates GPC R-ind u cedproli f erationand motility o f cancer cells［J］.Embo J，2003，22（10）:2411-2421.

［12］S I NN A T H A M BY G，Z E R F A SS J，H A F NE R J，et al.A D A M metallopeptidase domain 17（A D A M17）is nat u rally processed thro u g hma j orhistocompatibilitycomple x（M H C）classI molec u les and is a potential imm u notherape u tic tar g et in breast，o v arian and prostate cancers［J］.C lin E x p I mm u nol，2011，163: 324-332.

［13］刘爽，马荣.A D A M17在恶性肿瘤中的研究及其进展［J］.现代生物医学进展，2013，13（17）:3386-3389.

［14］马雷，吴爱国，纪术峰，等.短发夹R N A沉默S100A4基因对乳腺癌MC F-7细胞体外增殖和迁移力的抑制［J］.肿瘤防治研究，2010，37（4）:402-406.

［15］赵婷婷，邢鹏，金锋，等.缺氧对人乳腺癌细胞系MC F-7生物学行为的影响［J］.现代肿瘤医学，2014，22（5）:1015-1019.

［16］张博，张雪鹏，胡宝山，等.缺氧对人乳腺癌MC F-7细胞mi R N A-21表达的影响及与细胞增殖和凋亡的关系［J］.肿瘤学杂志，2014，20（4）:265-269.

（申海菊 编辑）

Effect of silencing ADAM 17 gene on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells under hypoxia*

Guo-fu Chen，Li-jun Wu，Xue-peng Zhang，Zhun Cai，Xiang-chao Meng
（Department of Surgical Oncology，the Affiliated Hospital，North China University of Science and Technology，Tangshan，Heibei 063000，China）

Objective To investigate the effects of short hairpin RNA（shRNA）targeting at a disintegrin and metalloproteinase 17（ADAM17）gene on proliferation of human breast cancer MCF-7 cells under hypoxia. M ethods The specific ADAM17-shRNA expression vector was designed for ADAM17 gene.They were transfected into human breast carcinoma cell line MCF-7 cells by electroporation.Depending on cell culture conditions（normoxia or hypoxia）and cell transfection factors（blank control PBS，transfection with ADAM17-shNC，transfection with ADAM17-shRNA），experiment groups were divided into normoxic control group，normoxic shNC group，normoxic shRNA group，hypoxic control group，hypoxic shNC group and hypoxic shRNA group. Hypoxic environment was acquired by a three gas incubator filled with 1%O2，5%CO2and 94%N2.qRTPCR was used to study the expression levels of ADAM17.The proliferative ability and cell growth curve of MCF-7 cells were detected by iCELLigence.Cell cycle distribution of MCF-7 cells was analyzed by flow cytometry.Results The specific ADAM17-shRNA expression vector could effectively silence the expression of ADAM17 gene in human breast cancer MCF-7 cells under hypoxia［hypoxic shRNA group 2-△△CT=（0.55± 0.16）］.The proliferative ability and cell growth speed of MCF-7 cells were inhibited and the cell cycle wasdelayed by shRNA transfection and hypoxic incubation.Conclusions It suggests that the synergistic effect of ADAM17-shRNA and hypoxia inhibits the proliferation of tumor cells.

ADAM17；breast cancer；hypoxia；proliferation

R 737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.004

1005-8982（2016）15-0022-06

2015-12-28

河北省自然科学基金（No：C2010001767）；唐山市科学技术研究与发展计划项目（No：14130256B）

张雪鹏，E-mail：sy z x p@sina.com