肿瘤坏死因子-α基因多态性与中国汉族人群乙肝病毒感染的相关性研究*

刘丽军

（西藏民族大学医学院，陕西 咸阳 712082）

论著

肿瘤坏死因子-α基因多态性与中国汉族人群乙肝病毒感染的相关性研究*

刘丽军

（西藏民族大学医学院，陕西 咸阳 712082）

目的探讨中国汉族人群肿瘤坏死因子-α（TN F-α）基因单核苷酸多态性（r s1800629和r s361525）与乙型肝炎病毒（H B V）感染的相关性。方法用T a q M a n探针对纳入的1 097例样本进行TN F-α、r s1800629和r s361525位点多态性检测，血样本包括429例慢性H B V感染者（C H组）、429例乙肝感染后自发清除者（S R组）及239例健康对照者（H C组）。结果①C H组与S R组比较，r s1800629 G A基因型与G等位基因与感染后病毒的自发清除有关［基因型：O R＾=0.369，P=0.000；等位基因：O R＾=2.210，P=0.000；显性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.536，P=0.000］。②C H组与S R组比较，SN P r s361525 G A基因型或A等位基因与感染后病毒的自发清除密切相关［基因型：O R＾=0.288，P=0.000；等位基因：O R＾=0.549，P=0.000；显性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.634，P=0.000］。结论TN F-α基因多态性与中国汉族人群H B V病毒感染后的自发清除密切相关。

乙型肝炎；单核苷酸多态性；肿瘤坏死因子-α基因

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B v ir u s，HBV）感染是我国面临的一个严峻的卫生问题。尽管大部分的感染者能自发清除病毒，但仍有约5%～10%的感染者发展为慢性感染［1］。半数以上慢性HBV感染患者病情稳定，可表现为无症状携带或轻度慢性肝炎。部分患者则会进展为肝硬化或肝癌等严重的肝病［2］。影响HBV感染结局的因素主要是宿主、病毒及环境3大因素，越来越多的证据表明宿主遗传因素在慢性HBV感染中发挥重要作用［3］。

肿瘤坏死因子-α（t u mor necrosis f actor-α，TN F-α）作为一种重要的细胞因子，被证实参与HBV病毒清除的过程［4］。近年来有报道称，TN F-α启动子区单核苷酸多态性位点rs1800629与rs361525与HBV慢性感染有关［5-7］，但结论不一致。因此，本研究通过病例对照方法来探讨TN F-α启动子区基因多态性（rs1800629和rs361525）与乙型肝炎病毒感染结局的相关性。

1　资料与方法

1.1研究对象

选取2011年1月-2015年6月就诊于西藏民族大学附属医院的无血缘关系的患者。其中包括正常对照组（H C组）、自发清除组（SR组）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，C HB）（C H组）、乙肝肝硬化（cirrhosis o f li v er，L C）、乙肝肝癌（hepatocell u lar carcinoma，H CC）。诊断标准参见《慢性乙型肝炎防治指南》。排除标准：①HBV血清两对半标志物不明确者；②仅有乙型肝炎表面抗体阳性（+）的HBV疫苗接种者；③艾滋病或其他非HBV肝炎病毒感染者；④严重的系统性疾病如系统性红斑狼疮、非H CC肿瘤等其他肝脏疾病；⑤如自身免疫型肝病、原发性胆汁性肝硬化等；⑥非汉族人。本研究得到西藏民族大学附属医院医学伦理委员会的批准，所有受试者签署书面的知情同意书。

1.2样本及生化指标的采集

采集每个受试者血液约3ml，置于-80℃冰箱冷冻保存备用。通过问卷调查方式收集其年龄、性别等基本情况。乙肝两对半、丙氨酸转氨酶（alanine aminotrans f erase，A L T）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotrans f erase，A S T）、血清总胆红素（total bilir u bin，T B I L）及乙肝病毒的脱氧核糖核酸（hepatitis B v ir u s-deo x yribon u cleic acid，HBV-DN A）水平的测定由本院检验科完成。

1.3DN A的提取与基因型分析

使用W i z ard G enomic DN A纯化试剂盒（美国P rome g a公司）提取外周血基因组DN A。NanoDrop 2000（美国Thermo S cienti f ic公司）测定DN A浓度及光密度值，并稀释成30 n g/μl备用。单核甘酸多态性（sin g le n u cleotide polymorphism，S N P）rs1800629 与rs361525分型采用Ta q M an探针法（美国A pplied B iosystems公司）。Ta q M an等位基因鉴别实验由A B I 7500快速实时荧光聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，R eal-time q PC R）系统完成（美国A pplied B iosystems公司）。其中每96孔设置1个阴性对照和1个阳性对照。聚合酶链式反应扩增反应体系为20μl，含30n g/μl DN A2μl，master mi x 10μl，primer-probe mi x 0.5μl及DN A ase-f ree w ater 7.5μl。PC R反应条件：95℃预变性10 min，92℃变性15 s，60℃退火1min，共39个循环。随机选取10%样本用同一方法重复验证以保证分型准确，基因分型错误率＜0.1%。

1.4统计学方法

采用S P SS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，H ardy-W einber g遗传平衡由 HW E软件完成，用S t u dent't检验或M ann-W hitney U检验，3组计量资料比较用方差分析；计数资料以用百分比或率表示，用χ2检验；基因型及基因模型使用二分类L o g istic回归校正年龄与性别后进行比较。使用H aplo v ie w so f t w are（v4.2）软件进行单体型分析。考虑到多重检验的问题，P＜0.0125（0.05/4）为差异有统计学意义。

2　结果

2.1基本资料及H ar d y-We i n ber g遗传平衡

2.1.1基本资料本研究共纳入1 097例患者，其中C H组429例，SR组429例，H C组239例。各组年龄比较，经方差分析，差异无统计学意义（F=0.080，P=0.923）。3组男女比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=63.210，P=0.000），C H组男性比例高于SR组与H C组。3组A L T、A S T、T B I L、HBV-DN A定量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=15.049，P=0.005；F=49.216，P=0.000；F=7.594，P=0.023；F= 15.004，P=0.005），C H组高于SR组及H C组。见表1。

2.1.2H a rd y-W e in b e r g遗传平衡rs1800629与rs361525均符合H ardy-W einber g遗传平衡（SR组：rs1800629位点P=0.085，rs361525位点P=0.199；H C组：rs1800629位点P=0.136，rs361525位点P= 0.451）。

2.2TN F-α rs1800629基因型与乙肝感染结局的关系

rs1800629 G是各组中最常见的等位基因。携带rs1800629 G A基因型与G等位基因有利于感染后病毒的自发清除，该保护性作用在显性遗传模型中仍存在［C H组v s SR组基因型：O R＾=0.369，P=0.000；等位基因：O R＾=2.210，P=0.000；显性模型（GG v s G A+ AA）：O R＾=0.536，P=0.000］（见表2）。在疾病进展方面，未发现多态性与疾病相关（见表3）。

2.3TN F-α rs361525基因型与乙肝感染结局的关系

携带G A基因型或A等位基因有利于感染后病毒的自发清除［C H组v s SR组基因型：O R＾=0.288，P= 0.000；等位基因：O R＾=0.549，P=0.000；显性模型（GG v s G A+AA）：O R＾=0.634，P=0.000］（见表2）。在疾病进展方面，未发现多态性与疾病相关（见表3）。

2.4TN F-α基因单体型与乙肝病毒感染结局的关系

表1　各组纳入研究者的人口学及临床特征比较

表2　慢性乙肝感染与TN F-α基因型的关系

表3　慢乙肝进展与TN F-α基因多态性的关系

考虑到单体型在解释多态性与疾病相关性上有更好的说服力，本研究以TN F-α两位点为基础构建单体型。但未发现两个位点之间能够构建单体型。

3　讨论

TN F-α是由单核巨噬系统细胞产生的细胞因子，具有免疫调节作用，增加I L-1、I L-8和粒-巨噬细胞集落刺激因子的分泌，提高I L-2R基因表达的水平，促进T细胞增殖，增强抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，促进B淋巴细胞增殖、分化和产生抗体等作用。

有研究发现，TN F-α 基因启动子区域内rs1800629和rs361525等S N P与丙型肝炎病毒感染、HBV感染及其抗病毒治疗应答相关［8-10］。本研究主要探讨 TN F-α 基因启动子区 rs1800629和rs361525位点多态性与HBV感染结局的相关性。

结果显示，我国人群TN F-α基因rs1800629和rs361525位点基因型均以GG为主，等位基因频率G＞A，与相关研究结果一致［6，11］。在HBV病毒感染后的自发清除方面，携带rs9275572 G等位基因表现出保护作用，且该效应在显性模型中也有体现。携带rs361525 G A基因型或A等位基因有利于感染后病毒的自发清除，且该效应在显性模型中同样得到印证。本实验结果与前人的研究一致［12-14］。rs1800629和rs361525位于TN F-α基因的启动子区，不同的等位基因，可能会影响TN F-α启动子的活性，进而影响TN F-α的表达，从而对HBV感染后的清除过程产生作用。

本研究将 rs1800629和 rs361525结合探讨TN F-α基因多态性与乙肝感染结局的关系。然而，对于这2个位点来说，本研究较之其他研究仍有相悖之处［6，11］，考虑可能存在以下原因：①S N P受种族、地域等因素的影响，导致其遗传差异显著，这也是导致该研究与其他文献报道差异的原因之一。②样本量与其他混杂因素的存在，例如基因或者环境因素。本研究也存在一定的不足之处，例如纳入研究的样本量不够多，这在一定程度上降低实验的信度。今后需要更大样本量、设计更严谨的实验进一步验证。

总之，本研究表明，中国人TN F-α基因多态性与HBV病毒感染后病毒的自发清除有关，一定程度上为慢性乙型肝炎的早预防和高应答率的治疗奠定基础。

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（童颖丹 编辑）

Association between TNF-αgene polymorphism s and chronic hepatitis B virus infection*

Li-jun Liu
（Medical College of Xizang Minzu University，Xianyang，Shannxi 712082，China）

Objective To assess the relation between two single nucleotide polymorphisms（rs1800629 and rs361525）of TNF-αgene and the outcomes of HBV infection in Chinese Han population．M ethods TNF-α （rs1800629 and rs361525）was genotyped by TaqMan probe method in 1，097 subjects，including 429 patients with chronic HBV infection（CH），429 HBV spontaneous clearance subjects（SR）and 239 healthy control individuals（HC）.Results rs1800629 GA genotype and G allele showed significant protective effect on HBV spontaneous clearance［CH vs SR:genotype:O R＾=0.369，P=0.000；allele:O R＾=2.210，P=0.000；dominant model （GG vs GA+AA）:O R＾=0.536，P=0.000］.SNP rs361525 showed a significant association with HBV spontaneous clearance.The rs361525 GA genotype and A allele played a protective role［CH vs SR:genotype:O R＾= 0.288，P=0.000；allele:O R＾=0.549，P=0.000；dominant model （GG vs GA+AA）:O R＾=0.634，P=0.000］. Conclusions TNF-αgene polymorphisms are associated with HBV spontaneous clearance．

hepatitis B；single nucleotide polymorphism；tumor necrosis factor-αgene

R 512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.016

1005-8982（2016）15-0087-04

2016-01-06

西藏自治区科技厅重点项目（No：Z2014A09G2-3）；西藏自治区科技厅项目（No：2015ZR-13-19）