2型糖尿病大鼠心肌纤维化气虚痰瘀证模型的建立*

潘继兴邓文祥曾　光李　亮陈青扬吴华英　　刘平安　　何军锋　黄惠勇，2△（.湖南中医药大学，湖南 长沙 40208；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 40007）



2型糖尿病大鼠心肌纤维化气虚痰瘀证模型的建立*

潘继兴1邓文祥1曾光1李亮1陈青扬1
吴华英1刘平安1何军锋1黄惠勇1，2△
（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410007）

目的 制备模拟人类发病过程的大鼠2型糖尿病心肌纤维化气虚痰瘀证模型。方法 用雄性5周龄SD大鼠40只，随机分为正常对照组8只、高糖高脂组8只、模型组24只，高糖高脂喂养4周造成胰岛素抵抗后，正常对照组和高糖高脂对照组分组予以普食和高糖高脂饲料喂养。模型组于第5周予以腹腔注射2次1%小剂量STZ，2次之间间隔48 h，糖尿病造模成功后，随机继续高糖高脂喂养22周。通过心肌病理Masson染色、免疫组织化学染色测定CollagenⅠ、CollagenⅢ和β-actin，氯胺T法测定羟脯氨酸表达。结果 模型组心肌病理切片及免疫组化结果显示存在心肌纤维化，正常组和高糖高脂组几乎没有；模型组TG、TC、LDL的值高于正常组；模型组和高糖高脂组胰岛素水平高于正常组；模型组脂联素水平低于正常组和高糖高脂组；模型组IL-1、TNF-α高于正常组和高糖高脂组；模型组羟脯氨酸、NTpro-BNP高于正常组和高糖高脂组。糖尿病大鼠在高糖高脂喂养8、12、16周，逐渐有血脂升高的趋势，开始出现高脂血症，NT-proBNp和羟脯氨酸逐渐升高，但心肌Masson染色显示心肌纤维化不明显，20周的病理切片显示心肌纤维化开始明显，随着高糖高脂喂养时间越久糖尿病大鼠精神状态越差，饮食减少、体力活动量逐渐减少，趋向死亡的数量增加。结论造模成功后，大鼠的病理因素有痰和瘀，病位在脾和肾，证明2型糖尿病心肌纤维化气阴两虚、痰瘀互结证模型成立。

糖尿病糖尿病心肌病糖尿病心肌纤维化

【Abstract】Objective：To establish Qi-asthenia and phlegm-stasis model in type 2 diabetic rats with myocardial fibrosis to imitate Pathogenesis of human.Methods：40 5-week-old SD rats were randomly divided into the control group（n=8），high-sugar and high-fat group（n=8），and the model group（n=24）.High-sugar and high-fat group were fed for 4 weeks，causing insulin resistance.The control group and high-sugar and high-fat group were fed with normal food and high-sugar and high-fat food，respectively.In the fifth week，the model group received intraperitoneal injection with 1%low dose of STZ for twice，interval between two 48 h.After successful modeling of diabetes，they randomly continued to be fed with high-sugar and high-fat food for 22 weeks.Collagen I，Collagen III and α-actin were detected with Masson staining of Myocardial pathology and immunohistochemistry；Hydroxylproline was detected with Chloramine T method.Results：In the model group，the myocardial pathological sections and the results of immunohistochemistry showed that there was myocardial fibrosis，which，however，didn't exist in the control group and high-sugar and high-fat group.TG，TC and LDL in the model group was higher than that of the control group.The insulin level in the model group and high-sugar and high-fat group was higherthan that of the control group；adiponectin level in the model group was lower than that of the control group and high-sugar and high-fat group；IL-1，TNF-α in the model group was higher than that of the control group and high-sugar and high-fat group，as well as Hydroxylproline and NTpro-BNP.Diabetic rats were fed with high glucose and high fat for 8 w，12 w，and 16 w.There is a trend of increasing blood lipids；hyperlipidemia began to appear；NT-proBNp and Hydroxylproline gradually rose，but myocardial Masson staining showed no significant myocardial fibrosis.Pathological section in 20 th week showed significant myocardial fibrosis.The longer they were fed with high glucose and high fat，the worse the mental state of diabetic rats，with reduced diet，reduced physical activity，and increased number of deaths.Conclusion：From the point of view of traditional Chinese medicine，after the success of the model，the pathological factors of the rat have phlegm and blood stasis，and disease position lies in the spleen and kidney，which proves model establishment of the type 2 diabetic myocardial fibrosis of Qi and Yin deficiency，phlegm and blood stasis.

【Key words】Diabetes；Diabetic cardiomyopathy；Diabetic myocardial fibrosis

当前，糖尿病心肌纤维化逐渐成为糖尿病患者致死、致残的主要因素之一。寻求有效的防治方法是全球医疗面临的挑战性工作。糖尿病心肌纤维化是糖尿病患者常见的心血管并发症，心肌间质纤维化在糖尿病心肌病的发生发展中起着重要作用，是糖尿病心肌病的特征性病理表现［1］。根据糖尿病心肌纤维化造模建立困难，有关研究很滞后。少数2型糖尿病心肌纤维化模型造模意见不统一，造模成功率不可预见［2-4］，且成功率低。笔者经过多次尝试大鼠2型糖尿病心肌纤维化造模，本实验重点研究SD大鼠2型糖尿病心肌纤维化的建立及从中医辨证角度探讨其证型是否为气阴两虚、痰瘀互结证模型。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物实验动物为40只SPF级SD雄性大鼠，体质量140～160 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号 SYXK（湘）2013-0005；屏障环境：湖南中医药大学实验动物中心，许可证号SCXX（湘）2011-0003；合格证编号43004700012925。饲养处及实验地：湖南中医药大学实验动物中心SPF实验室，室温（20±3）℃，相对湿度55%～70%，自由饮水，分笼饲养。

1.2饲料配方1）高糖高脂饲料：60%kcal%Fat，规格为12.5 kg/箱，货号为D12492，生产厂商为Research Diets；保存温度为2～6℃。2）普通饲料：实验鼠全价饲料，由湖南中医药大学实验动物中心制作提供。成分：玉米粉53%、豆饼粉24%、麦麸16%、鱼粉5%、骨粉1%、食盐1%，其他营养添加剂均按产品说明添加。所有饲料均进行高温消毒与辐射照射处理。

1.3试剂链脲佐菌素 （STZ）（美国Sigma公司，批号：MFCD00006607）；总胆固醇（TC）测定试剂盒，三酰甘油（TG）测定试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒，糖化血清蛋白测定试剂盒，葡萄糖（Glu）测试盒，脂联素（ADP）测试盒，胰岛素（Insulin）测试盒，C反应蛋白（CRP）测试盒（南京建成公司）。ELISA Kit for NTerminal Pro-Brain Natriuretic Peptide（NT-ProBNP）（优尔生，批号：SEA485Ra）。羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成，A030-2）。Rat IL-6 ELISA kit（欣博盛，批号ERC003.96）。Rat TNF-α ELISA kit（批号ERC102a. 96）。Anti-Collagen I antibody（批号ab34710）。Anti-Collagen III antibody（批号ab7778）。Anti-Actin-α（货号：bs-0189R，上海恪敏生物科技有限公司）。

1.4方法5周龄雄性SD大鼠40只，体质量140～160 g。适应性饲养1周后，按随机数字表法分为正常组（n=8）、高糖高脂组（n=32），正常组予以普通饲料，高糖高脂组予以高糖高脂饲料喂养4周。4周后留8只做高糖高脂组做对照，剩下24只大鼠完成糖尿病造模，腹腔注射1%小剂量STZ，注射剂量按25 mg/kg+体表面积，mg/（kg·m2）计算STZ剂量方法：体质量≤200 g的部分按25 mg/kg计算STZ量，＞200 g的部分按162.5 mg/m2［体质量的表面积=大鼠体型系数（0.09）×体质量2/3］计算STZ量，二者相加为1次STZ的注射用量，溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液中，pH值4.5。间隔48 h后，再按上述方案注射一次STZ。正常组予以2次腹腔注射等体积 0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液。最后一次注射STZ后的第6日，禁食12 h后，尾静脉测空腹血糖（FBG）和随机血糖，以2次空腹血糖＞11.1 mmol/L和（或）餐后血糖＞16.7 mmol/L，为2型糖尿病大鼠成模标准。造模成功率为87.5%，21只大鼠复制2型糖尿病模型［5］。将造模成功的2型糖尿病大鼠都继续予以高糖高脂饮食喂养22周诱导糖尿病心肌纤维化模型［6-8］。

1.5分组及给药将造模成功的21只2型糖尿病大鼠及高糖高脂组8只都继续予以高糖高脂饮食喂养22周，模型组可诱导糖尿病心肌纤维化模型，正常组普普通饲料喂养。正常组和高糖高脂组大鼠分别给予等体积灭菌用水灌胃。第6周末，死亡2只，被淘汰，18只空腹血糖≥11.1 mmol/L和（或）随机血糖≥16.7 mmol/L，并继续高糖高脂喂养22周，所有均自由饮水，最终存活9只验证为糖尿病心肌病组（其中自行死亡4只，分别于12周、18周、21周、22周死亡于肺部感染和糖尿病高渗性昏迷）。另外分别在第造模成功后第8周、12周、16周、20周取2只模型组大鼠（共8只）进行心肌Masson切片，采血测B型纳尿肽（NT-proBNP）和羟脯氨酸判断心肌有无心肌纤维化及纤维化程度，采血测血脂检测是否有高脂血症的发生，各组大鼠每天灌胃给药1次，连续灌胃22周［9，10］。

1.6动物处理及指标检测第23周处理全部动物，腹腔采血，取心肌、主动脉弓、胰岛。1）外观特征：各组大鼠体质量、进食量、饮水量、尿量、毛发变化情况、活动及精神状态、垫料潮湿情况、大便等指标。2）血液指标：灌胃结束后，大鼠隔夜禁食12 h，次晨取血，行血脂4项、CRP、糖化血红蛋白、糖化血清蛋白、血糖、ADP、胰岛素、NT-proBNP、羟脯氨酸检测。

1.7统计学处理应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，并对数据采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1处理后各组外观特征各项指标比较见表1。结果为注射STZ后，模型组与正常组和高糖高脂组相比，大鼠活动量明显减少，糖尿病模型成立后体质量先稳定后逐渐下降，日平均消耗饲料量、饮水量及尿量增多，垫料具有甜腻气味，喜溜边、扎堆，毛发变黄、易脱落，精神萎靡，尾部潮湿，模型组与正常组和高糖高脂组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1　各组处理后外观特征各项指标比较

2.2各组糖代谢、脂代谢指标比较见表2。检测结果显示，成模时与正常组比较，各组大鼠 FPG均明显升高（P<0.05）；模型组TG、TC、LDLC水平较高糖高脂组明显增高（P<0.05）。

表2　各组TC、TG、HDL、LDLC、CRP、FBG、糖化血清蛋白比较（mmol/L，±s）

表2　各组TC、TG、HDL、LDLC、CRP、FBG、糖化血清蛋白比较（mmol/L，±s）

组别　n TC　TG　HDL LDLC CRP FBG　　糖化血清蛋白正常组　8高糖高脂组　8 1.77±0.22　0.55±0.14　1.41±0.29 1.69±0.20　0.51±0.071.52±0.38 0.31±0.52 0.29±0.11 0.91±0.57 0.75±0.75 12.38±3.76　145.80±19.60 8.58±5.50　129.00±19.92模型组　91.98±0.39*△2.94±1.69*△0.99±0.240.39±0.23*△1.71±0.57*△29.87±1.39*△223.50±17.97*△

2.3各组胰岛素、ADP、NT-proBNP、IL-6、TNF-α水平变化情况比较见表3。结果为模型组与高糖高脂组各组胰岛素均大于0，且高于正常组（P<0.05），符合2型糖尿病模型，说明糖尿病大鼠存在胰岛素抵抗［11-12］；模型组的ADP、IL-6、羟脯氨酸水平低于其他组，胰岛素、NT-proBNP高于正常组（P<0.05）。

表3　各组胰岛素、ADP、NT-proBNP、IL-6、TNF-α、羟脯氨酸检测结果比较（±s）

表3　各组胰岛素、ADP、NT-proBNP、IL-6、TNF-α、羟脯氨酸检测结果比较（±s）

组　别　n 胰岛素（IU/mL）ADP （mg/mL）NT-proBNP （ng/mL）IL-6 （pg/mL）TNF-α （pg/mL）羟脯氨酸（μg/mL）正常组　8高糖高脂组 8 19.81±3.15　3.46±0.65　0.19±0.90 26.87±0.51　3.58±0.62　0.20±0.23 52.51±6.89 53.28±1.33 14.80±10.81 22.12±4.87 11.47±8.57 5.63±3.93模型组　925.85±4.10*△7.61±0.33*△0.27±0.11*△68.86±9.83*△31.97±0.53*△15.30±9.09*△

2.4各组心肌切片Masson染色结果比较见图1。结果示正常组和高糖高脂组心肌纤维走行正常，心肌细胞核呈圆形或椭圆形，居细胞中央，心肌间质及微血管结构正常。STZ+高糖高脂组组：心室细胞轻度肿胀，心肌纤维及心室结构排列紊乱，胶原沉积，横纹不清。Masson染色，STZ+高糖高脂组蓝颜色范围大于正常组与高糖高脂组，提示心肌纤维化程度高于正常组与高糖高脂组。

图1　大鼠左室心肌心肌组织Masson染色切片（×400）

2.5各组心肌免疫组化结果见图2～4。结果为模型组的college1和college3高于正常组；α-肌动蛋白低于正常组，符合心肌纤维化的诊断［13-14］。

图2　各组α-肌动蛋白比较（×200）

图3　各组Collagen1比较（×200）

图4　各组Collagen3比较（×200）

3　结　论

笔者通过采用高脂高糖膳食喂养1周后，采用腹腔注射STZ复制糖尿病大鼠模型，在糖尿病模型基础上再继续高糖高脂组喂养22周，糖尿病大鼠明显表现有高血糖、血脂紊乱、高胰岛素血症、胰岛素敏感性下降、心肌纤维化、脂联素水平降低、IL-6、TNF-α、NT-proBNP、羟脯氨酸升高，表明2型糖尿病心肌纤维化的模型成立。

结果模型组心肌病理切片及免疫组化结果显示存在心肌纤维化，正常组和高糖高脂组几乎没有；模型组TG、TC、HDLC的值高于正常组，LDLC低于正常组和高糖高脂组；模型组和高糖高脂组胰岛素水平高于正常组，说明模型组存在高胰岛素血症，存在胰岛素抵抗；模型组脂联素水平低于正常组和高糖高脂组；模型组IL-6、TNF-α高于正常组和高糖高脂组；模型组羟脯氨酸、NTpro-BNP高于正常组和高糖高脂组，也说明模型组的心肌纤维化的指标升高，心肌受损。糖尿病大鼠在高糖高脂喂养8周、12周、16周，逐渐有血脂升高的趋势，开始出现高脂血症，NT-proBNp和羟脯氨酸逐渐升高，但心肌Masson染色显示心肌纤维化不明显，20周的病理切片显示心肌纤维化开始明显，随着高糖高脂喂养时间越久糖尿病大鼠精神状态越差，饮食减少、体力活动量逐渐减少，趋向死亡的数量增加。

造模成功后，糖尿病心肌纤维化大鼠有多饮、多食、多尿、体质量减轻的及少动懒动、精神萎靡、抱团扎堆、毛发发黄、粗糙、掉毛的表现，符合中医“气阴亏虚证”的表现［15］；大鼠形体肥胖，舌质胖大，舌苔可见痰，高血脂、高胰岛素血症、低脂联素水平符合中医的“痰证”的表现；其舌色、爪色比正常组大鼠要深，呈淡紫色，心肌纤维化，符合中医的“瘀证”的表现。从中医的角度推之，造模成功后，大鼠的病理因素有痰和瘀，病位在脾和肾，证明2型糖尿病心肌纤维化气阴两虚、痰瘀互结证模型成立。

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Establishment of Qi-asthenia and Phlegm-stasis Model in Type 2 Diabetic Rats with Myocardial Fibrosis

PAN Jixing，DENG Wenxiang，ZENG Guang，et al.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）06-0953-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.004

国家自然科学基金面上项目（81373551）；教育部博士点博士导师课题（20134323110001）；湖南省科技厅社会发展支撑计划重点项目（2014S2032）；湖南省中医药科研计划项目（2014153）；湖南省研究生创新课题 （CX2015B332），中医诊断学国家重点学科建设项目 （2013ZYZD04，2014-5，2014-28，ZYZD2015B32）；湖南省学位与研究教育教学改革研究课题（JG2015B068）

△（电子邮箱：huanghy68@126.com）

（2015-08-09）