HPLC法快速测定生脉注射液指纹图谱*

赵炳祥　董　礼［华润三九（雅安）药业有限公司，四川 雅安 625000］



HPLC法快速测定生脉注射液指纹图谱*

赵炳祥董礼△
［华润三九（雅安）药业有限公司，四川 雅安 625000］

目的采用小粒径色谱柱和HPLC法，建立生脉注射液指纹图谱快速测定方法。方法 色谱柱采用Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱；流速为2 mL/min；检测波长为203 nm；柱温为30℃；进样量为4 μL。检测10批生脉注射液，并建立对照指纹图谱。以指纹图谱轮廓计算快速法对照指纹图谱与法定对照指纹图谱相似度。结果 快速法对照指纹图谱与法定对照指纹图谱相似度为0.944。结论快速测定法色谱轮廓与法定标准法一致。该方法检测快速、准确、可靠，可取代法定标准中指纹图谱检测法。

指纹图谱生脉注射液快速测定相似度

【Abstract】Objective：To establish a rapid detection of the fingerprint of Shengmai injection with small diameter column and HPLC method.Method：The analysis was performed on a Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）.Mobile phase was acetonitrile-water with gradient elution；flow rate was 2.0mL/min；detection wavelength at 203 nm；column was 30℃，and injection volume was 4 μL.Then it conducted a new standard fingerprint by ten batches of Shengmai injection detection with the new method，and rapid method for calculating contour of fingerprints were compared between new standard fingerprint and legal standard fingerprint with profile data to find out the similarity.Result：The similarity between rapid standard fingerprint and legal standard fingerprint was 0.944.Conclusion：The chromatographic profile of the new method IS consistent with the legal standard chromatographic profile.And it is rapid，accurate and stable，which can replace the detection method of fingerprint in legal standard.

【Key words】Fingerprint；Shengmai injection；Rapid detection；Similarity

生脉注射液为华西医科大学药学院根据我国古验方“生脉散”研制而成的中药注射剂，由红参、麦冬、五味子3味药组成［1］。广泛应用于心脑血管疾病（如心力衰竭、低血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛、心律失常、心肌梗死、脑梗死等）的治疗，并取得了良好的治疗效果［2-4］。2011年10月25日，由国家药典委员会审定，国家食品药品监督管理局颁布正式执行生脉注射液新质量标准［5］。该标准在原标准的基础上增加了指纹图谱相似度评价，对生脉注射液的质量稳定性、有效性控制起着十分重要的作用。近年来，随着超高效（快速）液相色谱（UPLC、UHPLC）的应用，小粒径色谱迅速进入了色谱分析领域。超高效液相色谱能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究［6］。但是超高效（快速）液相色谱系统的价格昂贵、市场占有率较低、企业配置UPLC或UHPLC较少。因此，利用HPLC分析系统，结合小粒径色谱柱，建立快速、准确的生脉注射液指纹图谱分析方法，是本文研究的主要目的。

1　材料与方法

1.1仪器与材料Agilent 1260高效液相色谱仪 （安捷伦科技有限公司，泵模块型号：G1311B），METTLER TOLEDO XA205DU型电子天平 （梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）。乙腈（色谱纯，Merk）；超纯水；人参皂苷Rg1（批号 110703-200726）、Re（批号110754-200822）、Rb1（批号110704-200420）、五味子醇甲（批号110857-201010）购于中国食品药品检定研究院。生脉注射液由雅安三九药业有限公司生产。

1.2色谱条件采用Waters X-BridgeTMBEH ShieldRP18（4.6 mm×100 mm，2.5 μm）色谱柱；乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～6min，0%A→10%A；6～8 min，10%A→23%A；8～10 min，23%A→23%A；10～17 min，23%A→60%A；17～19 min，60%A→100%A）；流速2 mL/min；检测波长203 nm；柱温：30℃；进样量4 μL［7］。

1.3参照物溶液的制备取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、五味子醇甲适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含0.10 mg、0.08 mg、0.20 mg和0.02 mg的混合溶液，即得［5］。

1.4供试品溶液的制备取生脉注射液适量，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.5精密度试验取同1份供试品溶液，按“1.2”项下条件连续进样6次，测定特征峰（17个）相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

1.6重复性试验取同一批样品6份，按“1.2”项下条件分别进样，测得其特征峰（17个）峰面积相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3.5%，表明重复性良好。

1.7稳定性试验取同一份供试品溶液，按“1.2”项下条件分别在0、2、4、8、12、24 h进行测定，其特征峰（17个）峰面积相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

1.8耐用性试验取同一份供试品溶液，按“1.2”项下条件在另外2台Agilent 1260高效液相色谱仪中进样，记录色谱图，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件计算相似度，3个色谱图相似度（17个特征峰匹配）为1.00，表明该方法仪器间使用耐用性良好。

2　结　果

2.1对照指纹图谱的建立见图2。按“1.2”项色谱方法，检测10批生脉注射液供试品，记录色谱图，见图1；选择稳定性好、吸收强、特征明显的色谱峰为共有峰，共选定17个峰。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件，以特征峰匹配，建立对照指纹图谱。

图1　快速法生脉注射液指纹图谱

图2　快速法生脉注射液　对照指纹图谱

2.2相似度评价对比新建对照指纹图谱和法定对照指纹图谱（图3），两者色谱图出峰相似；但二者色谱图相似度具体多少，需要进一步进行评价。本研究以标准图谱轮廓数据点相似度进行评价。

2.3指纹图谱轮廓预处理将新建对照指纹图谱轮廓所有数据点乘以5，保存轮廓数据。导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件，与法定对照图谱进行特征峰匹配（17特征峰），见图4。将匹配后的新建对照图谱和法定对照图谱数据导出，得到匹配后的数据点。进一步删除多余数据点，最终得到5200组信号数据。

图3　　生脉注射液法定对照指纹图谱

图4　　数据点匹配后的　对照指纹图谱

2.4对照图谱相似度计算对2.3处理后的图谱数据，利用夹角余弦法［8］计算新对照指纹图谱和法定对照指纹图谱的相似度，结果相似度为0.944，说明快速指纹图谱法所测指纹图谱与法定标准法所测指纹图谱相似度高，可以取代法定标准法。

3　讨　论

利用HPLC研究生脉注射液指纹图谱，分析时间较长，大约100 min［9-10］；而利用超高效液相色谱（UPLC）建立生脉注射液指纹图谱，分析时间约25～40 min［11-12］；本研究建立的指纹图谱分析方法为19 min，大大提高了分析效率。已报道采用 Waters X-BridgeTMBEH Shield RP18（4.6×100 mm，2.5 μm）色谱柱，建立了参麦注射液指纹图谱快速测定法，利用峰面积相似度评价快速指纹图谱法与法定方法检测结果的一致性［7］。本研究以生脉注射液为研究对象，建立生脉注射液的快速测定法，并利用轮廓相似度评价色谱图的一致性，结果发现快速指纹图谱法所测指纹图谱轮廓与法定标准法轮廓基本一致。生脉注射液指纹图谱色谱图轮廓，能全面反映色谱图的所有信息，保持了中药多成分信息的完整性［13-15］；以色谱图轮廓信息进行相似度计算，相对于特征峰面积相似度计算，更能反应快速分析方法与法定分析方法的一致性。

生脉注射液指纹图谱快速分析法，分析速度快、结果稳定、与法定方法结果一致，可取代法定标准指纹图谱检测方法。

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Rapid Detection of Fingerprint of Shengmai Injection by HPLC

ZHAO Bingxiang，DONG Li.China Re-sources Sanjiu（Ya′an）Pharmaceutical Co.，Ltd.，Sichuan，Ya′an 625000，China.

R91文献标志码：A

1004-745X（2016）06-0965-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.007

国家重大新药创制科技重大专项（2009ZX09502-030）

△（电子邮箱：dongli@ya999.com）

（2015-12-20）