黄芪预处理对大鼠肠系膜缺血再灌注损伤后氧化应激和炎症反应的抑制作用*

裴志萍　牛文革　柴静波　孟　洁（河北省邯郸市第二医院，河北 邯郸 056001）



黄芪预处理对大鼠肠系膜缺血再灌注损伤后氧化应激和炎症反应的抑制作用*

裴志萍△牛文革柴静波孟洁
（河北省邯郸市第二医院，河北 邯郸 056001）

目的 研究黄芪预处理对大鼠肠系膜缺血再灌注损伤后氧化应激和炎症反应的抑制作用。方法 取120只实验用大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、银杏叶提取物（3.15 mg/kg）预处理组和黄芪（5、10、20 g/kg）预处理组；术前7 d开始腹腔注射给药（每日1次）。通过夹闭肠系膜上动脉后去夹恢复血流再灌注的方法制备肠系膜缺血再灌注损伤大鼠模型；再灌注2 h后，测定肠组织含水量，HE染色观察肠组织病理变化并进行损伤评分（Chiu′s氏评分）；检测肠组织中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-Px、过氧化氢酶（CAT）］活性和丙二醛（MDA）含量；测定血清中总抗氧化能力（T-AOC）水平和一氧化氮（NO）含量；酶联免疫法（ELISA）测定肠组织中炎症细胞因子（CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）和内毒素水平。结果 与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠肠组织含水量显著降低（P<0.05或P<0.01）；黄芪预处理组大鼠肠系膜病变较模型组均明显改善，其中黄芪（10、20 g/kg）预处理组Chiu′s氏评分显著降低（P<0.05或P<0.01）；黄芪（10、20 g/kg）预处理组肠组织中SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低（P<0.05或P<0.01），血清中NO、CRP、TNF-α、IL-6含量和内毒素水平显著降低（P<0.05或P<0.01）；其中黄芪（20 g/kg）预处理组肠组织中GSH-Px活性和血清中T-AOC含量显著升高（P<0.05），血清中cGMP、IL-10含量显著升高且IL-1β含量显著降低（P<0.05或P<0.01）。结论 黄芪预处理具有抑制大鼠肠系膜缺血再灌注损伤后氧化应激和炎症反应的作用，从而对肠系膜缺血再灌注损伤起到保护作用。

肠系膜缺血再灌注黄芪预处理氧化应激炎症反应

【Abstract】Objective：To investigate the inhibition of Astragalus pretreatment on oxidative stress and inflammation in intestinal ischemia-reperfusion rats.Methods：120 expremental rats were randomly devided into sham operation group，the model group，Ginkgo biloba extract（GB，3.15 kg）pretreatment group and Astragalus（5，10，20 g/kg）pretreatment groups.Severn days before surgery，the drugs were given by intraperitoneal injection，once a day.The rat models were made by clipping superior mesenteric artery；two hours later，the water content was detected；the histopathological changes of intestinal tissue was observed by HE staining and the Chiu′s score was detected；the activity of SOD，GSH-Px，CAT and the content of MDA in intestinal tissue were detected；the level of T-AOC and the content of NO，cGMP in serum were detected；the level of CRP，TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10 and endotoxin in intestinal tissue were detected.Results：Compared with the model group，the water content in Astragalus（10，20 g/kg）pretreatement groups were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；the histopathological changes of intestinal tissue in Astragalus pretreatement groups were significantly improved，the Chiu′s score in Astragalus（10，20 g/kg）pretreatement groups were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01），the activity of SOD，CAT in intestinal tissue were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased（P< 0.05 or P<0.01），the level of NO，CRP，TNF-α，IL-6 and endotoxin in intestinal tissue of Astragalus（10，20 g/kg）pretreatement groups were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；the activity of GSH-Px and the level of T-AOC in intestinal tissue were significantly increased（P<0.05），the content of cGMP and the level of IL-10 inserum were significantly increased（P<0.05 or P<0.01），IL-1β was significantly decreased（P<0.01）.Conclusion：Astragalus pretreatment has inhibitive effects on oxidative stress and inflammation in intestinal ischemiareperfusion rats，which exhibits protective effect on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.

【Key words】Intestinal ischemia-reperfusion；Astragalus；Pretreatment；Oxidative stress；Inflammation

黄芪为为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的根，始载于《神农本草经》，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌之功效，为常用中药之一。现代药理学研究发现，黄芪预处理能够抑制氧化应激损伤、降低炎症反应而表现出对脑组织和心肌组织缺血再灌注损伤的保护作用［1-2］，但对肠系膜缺血再灌注损伤是否具有保护作用，仍未见文献报道。本实验采用黄芪预处理7 d后，通过夹闭肠系膜上动脉45 min后去夹恢复血流再灌注的方法制备的肠系膜缺血再灌注大鼠模型，研究黄芪预处理对大鼠肠系膜缺血再灌注损伤的保护作用并探讨其可能的作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1药物与试剂

黄芪注射液（成都地奥九泓制药厂生产，规格为20 g/10 mL，批号为20141209）；银杏叶提取物（神威药业集团有限公司生产，规格为17.5 g/5 mL，批号为140725）；HE试剂盒试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；一氧化氮（NO）、环鸟苷酸（cGMP）、C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β （IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和内毒素酶联免疫法（ELISA）检测试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；血清中总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-Px、过氧化氢酶（CAT）活性测定试剂盒和丙二醛（MDA）含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠，8周龄，体质量180～220 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2008-1-003。

1.3实验仪器

UV759型紫外-可见分光光度计 （上海圣科仪器设备有限公司）；F50型酶标仪 （瑞士TECAN公司）；CUT4062型石蜡切片机（德国SLEE公司）；IX71型倒置光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.4分组与给药

将120只实验用大鼠随机分为假手术组、模型组、银杏叶提取物（3.15 mg/kg）预处理组和黄芪（5、10和20 g/kg）预处理组；各预处理组于术前7 d开始腹腔注射给药，每日1次，其中假手术组和模型组分别给予等体积的0.9%氯化钠注射液。

1.5模型制备

肠系膜缺血再灌注大鼠模型的制备：术前12 h禁食，麻醉后仰位固定，开腹并暴露肠系膜上动脉，用无创动脉夹夹闭45 min后去夹恢复血流再灌注，制备肠系膜缺血再灌注大鼠模型［3］。

1.6标本采集与检测

再灌注2 h后，取材并进行各指标的检测。

1.6.1肠组织含水量的测定腹腔注射乌拉坦实施麻醉后，开腹取回盲部10 cm以上的相同部位4 cm的肠管，用0.9%氯化钠注射液冲洗干净后，秤量湿质量（W1）；然后将该肠段置于107℃烘烤72 h后称干质量（W2），计算肠组织含水量：含水量（%）=［（W1-W2）/W1］×100%。

1.6.2肠组织病理性形态学变化的观察及Chiu′s氏评分参照1.6.1方法取各组大鼠肠管，用0.9%氯化钠注射液冲洗干净，置于4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片和展片处理后，行常规HE染色，然后通过光学显微镜观察各组大鼠肠组织病理性形态学变化；参照Chiu等［4］报道的评分标准（Chiu′s氏6级评分标准）进行肠组织损伤评分，0分：结构正常。1分：肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽。2分：绒毛尖端上皮抬高与固有层剥离。3分：绒毛两侧上皮成块脱落。4分：上皮完全脱落，仅存固有层结构。5分：黏膜固有层崩解、出血和溃疡。

1.6.3肠组织中抗氧化酶活性及MDA含量的测定

参照“1.6.1”项下方法取回盲部10 cm以上的相同部位肠管，冲洗干净，加入适量冷裂解液后进行研磨匀浆，经3000 r/min离心10min后取上清液，然后按照各试剂盒操作方法步骤进行处理，通过紫外-可见分光光度计测定各组大鼠肠组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和MDA含量。

1.6.4血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量的测定于“1.6.3”项取肠组织前，通过腹主动脉取血并离心取血清，根据各试剂盒操作方法步骤进行处理，然后通过紫外-可见分光光度计测定各组大鼠血清中T-AOC水平，通过酶标仪测定各组大鼠血清中NO、cGMP含量。

1.6.5肠组织中炎症细胞因子含量和内毒素水平的测定取“1.6.3”项下所制备的肠组织匀浆上清液，按照ELISA试剂盒操作步骤逐步进行处理，然后通过酶标仪平行测定各组大鼠肠组织中炎症细胞因子（CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）含量和内毒素水平。

1.7统计学处理

2　结　果

2.1各组大鼠肠组织含水量比较

见表1。模型组大鼠肠组织含水量较假手术组显著升高（P<0.01）；与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠肠组织含水量显著降低 （P<0.05或P< 0.01）。

表1　各组大鼠肠组织含水量和Chiu′s氏评分比较（分，±s）

表1　各组大鼠肠组织含水量和Chiu′s氏评分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别　n　Chiu′s氏评分（分）假手术组　10　0.32±0.15模型组　10　4.18±0.63**黄芪（5 g/kg）预处理组　10　3.79±0.82含水量（%）72.75±4.13 84.31±5.04**83.59±5.15黄芪（10 g/kg）预处理组　10　2.86±0.64△79.46±4.83△黄芪（20 g/kg）预处理组　10　76.12±4.50△△　2.07±0.49△△银杏叶提取物预处理组　10　78.35±3.87△　2.53±0.57△

2.2各组大鼠肠系膜病理性形态学变化及损伤评分（Chiu′s氏评分）比较

见表1。观察病理切片发现：假手术组大鼠肠绒毛完整、排列整齐，未见病理性形态学变化；模型组大鼠肠组织呈现明显的病理性形态学变化：黏膜上皮细胞脱落，绒毛尖端上皮抬高与固有层分离，中性粒细胞浸润等；与模型组比较，黄芪预处理组大鼠肠组织病理性形态学变化明显较轻，其中以黄芪（20 g/kg）预处理组效果最为显著，见图1。各组大鼠肠组织损伤Chiu′s氏评分结果：模型组大鼠肠组织Chiu′s氏评分较假手术组显著升高（P<0.01）；与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠Chiu′s氏评分显著降低 （P< 0.05或P<0.01）。

图1　各组大鼠肠系膜病理性形态学变化（HE染色，×200）

2.3各组大鼠肠组织中抗氧化酶活性活性和MDA含量比较

见表2。模型组大鼠肠组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性较假手术组显著降低且MDA含量显著升高（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低 （P<0.05或P<0.01），其中20 g/kg预处理组GSH-Px活性显著升高（P<0.05）。

表2　各组大鼠肠组织中抗氧化酶活性活性和MDA含量比较（±s）

表2　各组大鼠肠组织中抗氧化酶活性活性和MDA含量比较（±s）

组别　n假手术组　10模型组　10黄芪（5 g/kg）预处理组　10 CAT（U/mg）MDA（nmol/mg）26.91±5.04　5.48±1.29 14.65±4.17**　17.52±3.01**16.49±3.83　14.86±2.75黄芪（10 g/kg）预处理组　10　42.60±5.29△　3.65±1.32　20.68±4.01△　11.27±2.38△△黄芪（20 g/kg）预处理组　10　55.07±6.43△△　4.12±1.57△　25.27±5.24△△　8.15±1.73△银杏叶提取物预处理组　10　46.23±5.99△　3.79±1.43　21.08±3.62△　7.40±1.89△△SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）68.49±7.06　4.72±1.36 35.02±4.87**　3.08±1.24*38.35±5.71　3.26±1.39

2.4各组大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量比较

见表3。模型组大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量较假手术组均显著降低 （P<0.05或P< 0.01）；与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠血清中NO含量显著升高（P<0.05或P<0.01），其中20 g/kg预处理组T-AOC水平和cGMP含量显著升高（P<0.05或P<0.01）。

表3　各组大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量比较（±s）

表3　各组大鼠血清中T-AOC水平和NO、cGMP含量比较（±s）

组别　n假手术组　10模型组　10黄芪（5 g/kg）预处理组　10 cGMP（pmol/mL）10.51±0.94 7.37±1.22*7.89±1.48黄芪（10 g/kg）预处理组　10　9.98±2.46　12.55±2.48△　8.63±1.02黄芪（20 g/kg）预处理组　10　11.73±3.35△15.03±3.17△△　9.27±1.69△银杏叶提取物预处理组　10　9.82±2.58△11.84±1.92△　8.24±1.13 T-AOC（U/L） NO（ng/mL）17.59±3.83　19.73±2.26 8.31±2.15**　8.54±1.41**9.07±2.68　10.06±1.72

2.5各组大鼠肠组织中炎症细胞因子含量和内毒素水平比较

见表4。模型组大鼠肠组织中CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量和内毒素水平较假手术组显著升高，IL-10含量显著降低 （P<0.01）；而与模型组比较，黄芪（10、20 g/kg）预处理组大鼠肠组织中CRP、TNF-α、IL-6含量和内毒素水平显著降低，其中20 g/kg预处理组IL-1β含量显著降低且IL-10含量显著升高 （P<0.05 或P<0.01）。

3　讨　论

肠系膜缺血再灌注损伤病理机制非常复杂，病理机制尚不明确。近年来，有研究发现，氧化应激损伤、炎症反应可能是其重要发病机制之一［5-6］，这也为我们今后研发抑制肠系膜缺血再灌注损伤的新型药物提供了新的思路。

表4　各组大鼠肠组织中炎症细胞因子含量和内毒素水平比较（±s）

表4　各组大鼠肠组织中炎症细胞因子含量和内毒素水平比较（±s）

组别　n假手术组　10模型组　10黄芪（5 g/kg）预处理组　10 IL-10（ng/g）　　内毒素（kEu/g）10.43±1.52　0.13±0.04 52.06±7.39**　1.02±0.19**58.27±6.84　0.92±0.25黄芪（10 g/kg）预处理组　10　137.03±20.75△　32.91±3.78△　77.58±8.13　148.24±35.71△△　62.86±8.35　0.74±0.16△黄芪（20 g/kg）预处理组　10　102.40±17.52△△20.53±3.14△△　62.41±7.09△△　106.50±31.43△△　67.03±9.52△　0.58±0.14△△银杏叶提取物预处理组　10　132.35±21.37△　34.15±4.01△　80.86±9.30　154.29±40.15△　59.35±7.24　0.83±0.20 CRP（mg/g）　TNF-α（ng/g）42.73±5.06　9.46±1.81 192.51±24.59**　47.20±6.34**164.82±27.48　41.59±5.72 IL-1β（ng/g）45.30±6.24 91.46±11.32**84.01±10.22 IL-6（ng/g）56.38±7.11 205.94±34.56**177.57±42.82

体内氧自由基过剩是导致氧化应激损伤的病理基础，正常生理状态下，体内生成的氧自由基能够在SOD作用下还原生成H2O2，并在CAT催化作用下进一步被还原生成对人体无害的H2O和O2［7-8］；脂质过氧化终产物MDA含量也能够间接反应肠系膜细胞氧化损伤程度。体内NO是一种信号分子，能够通过激活可溶性腺苷酸环化酶、升高细胞内cCMP含量而发挥刺激血管舒张、促进血液循环的生理作用［9-10］。此外，NO还具有降低血管反应性，维持肠黏膜的灌注，消除氧自由基、抑制脂质过氧化，改善微循的作用［11］。细胞炎性因子CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6是临床上用来监测体内炎症反应的常用指标；而IL-10是一种多功能负性调节因子，能够发挥下调炎症反应，拮抗炎性介质的作用；内毒素是一种对人体具有毒性作用的脂多糖，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克等。

本实验发现，黄芪预处理能够有效降低肠组织含水量，改善肠系膜组织病变、降低Chiu′s氏评分，改善肠组织中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性并降低MDA含量，提高血清中T-AOC水平和NO、cCMP含量，降低肠组织中炎症细胞因子（CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6）含量及内毒素水平、提高IL-10含量［12-15］；提示黄芪预处理对肠系膜缺血再灌注损伤大鼠氧化应激和炎症反应具有抑制作用，从而表现出对肠系膜缺血再灌注损伤大鼠的保护作用。

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Inhibition of Astragalus Pretreatment on Oxidative Stress and Inflammation in Intestinal ischemia-reperfusion Rats

PEI Zhiping，NIU Wenge，CHAI Jingbo，et al. The Seond Hospital of Handan，Hebei，Handan 056001，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）06-0967-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.007

河北省自然科学基金资助项目（08B033）

△（电子邮箱：zhjkpqq@163.com）

（2015-11-17）