山梨糖与羟脯氨酸的美拉德反应条件优化及抗氧化研究

张改红等

摘要：以山梨糖和羟脯氨酸为原料，通过单因素试验和正交试验，确定了较佳的美拉德反应条件，即当反应温度为160 ℃，反应时间5 h，pH为8，山梨糖和羟脯氨酸摩尔比为1∶2时，美拉德反应产物的质量最好。通过测定反应产物对DPPH自由基的清除率，结果表明美拉德反应产物可以作为抗氧化剂。利用GC-MS气质联用仪对反应产物进行了分离鉴定，检测到吡嗪、吡咯、吡啶等杂环化合物，这些物质是卷烟中的重要香气成分，为卷烟加香提供了一定的理论基础。

关键词：山梨糖；羟脯氨酸；美拉德反应；卷烟增香

中图分类号：TS264.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3133-04

Optimizing Conditions of Maillard Reaction for Sorbose and Hydroxyproline

and Its Antioxidation

ZHANG Gai-hong，CHENG Chuan-ling，YANG Yan-qin，SONG Hui，LI Rui-li，WANG Jian-min

（School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： Using sorbose and hydroxyproline as materials， the conditions of maillard reaction were optimized with single factor experiment and orthogonal test. When the reaction temperature was 160 ℃， reaction time was 5 h， the pH was 8， sugar ammonia molar ratio was 1∶2， cigarette perfuming effect of the maillard reaction products were the best. By measuring the clearance efficiency of DPPH free radical， the maillard products were proved to be as antioxidant. With gas chromatograph-mass spectrometer， some heterocyclic compounds such as pyrazine， pyrrole and pyridine were isolated and identified from the reaction products， which were the important aroma components in tobacco. It will provide a theoretical basis for enhancing cigarette perfuming.

Key words： sorbose； hydroxyproline； maillard reaction； cigarette perfuming

1912年，法国化学家美拉德（Louis-Camille Maillard）发现把葡萄糖和甘氨酸在水中加热一段时间，形成褐色的类黑精。1953年Hodge[1]把这个反应正式命名为美拉德反应。由于美拉德反应是烟草特征香味形成的重要反应，产物中含有许多香味成分，而且大部分与烟香谐调，因此，美拉德反应产物在卷烟增香方面的应用研究倍受青睐[2-5]。以山梨糖和羟脯氨酸为原料的美拉德反应及其产物在卷烟中的应用还未见报道。本试验以山梨糖和羟脯氨酸为原料，通过单因素和正交试验优化了反应条件，考察了其产物的抗氧化效果，并用GC-MS气质联用仪对反应产物进行了分离鉴定，为卷烟加香提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

D-山梨糖、L-羟脯氨酸（生化试剂，北京中生瑞泰科技有限公司）；1，2-丙二醇（分析纯）；丙三醇（分析纯）；无水硫酸钠、乙醚（分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司）。

1.2 试验仪器与设备

98-3型数显磁力搅拌器（郑州凯鹏实验仪器有限公司）、PL-203型电子天平（奥豪斯国际贸易上海公司）、Agilent 6890-5973型气相色谱质谱联用仪（安捷伦公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 美拉德反应条件的优化

1）单因素试验。主要研究不同的反应温度（100、120、140和160 ℃）、反应时间（2、3、4和5 h）；初始pH（6、8、9和10）、山梨糖和羟脯氨酸摩尔比（2∶1、1∶1、1∶2和1∶3）对美拉德反应产物在卷烟中加香效果的影响。在测定某一因素对美拉德反应产物加香效果的影响时，固定其他因素及其水平不变。

以反应温度为例，具体反应过程为：称取摩尔比为1∶1的山梨糖和羟脯氨酸，加入20 mL的丙二醇，用10%的NaOH溶液或者6 mol/L HCl调节pH为8，将其加入装有温度计、回流冷凝管和磁子的50 mL的圆底三口烧瓶中，置于放有油浴锅的磁力搅拌器上，30 min内分别加热至100、120、140、160 ℃，回流反应2 h。其他因素下的反应如上述，将相应的因素水平替换即可。

2）卷烟加香评吸试验。将不同因素不同水平下的反应产物用70%的乙醇溶液稀释成10%的溶液。取8 g烟丝，添加上述10%美拉德反应产物的乙醇溶液40 mg（按烟草质量的0.5%添加）；另取8 g烟丝，添加40 mg的70%乙醇溶液作为对照。将烟丝灌入空烟筒中（单支烟丝重750～800 mg），卷制成的烟支在相对湿度（60±3）%，温度（22±1） ℃的恒温恒湿箱中平衡48 h。组织专业人员对各试验卷烟进行对比评吸。评吸采用单支打分法，分别从卷烟的香气、谐调、杂气、刺激性、余味等5个方面进行评分（满分95分，5个方面的分值分别为32、6、12、20、25分），以空白样为标准作相对比较评价。感官评价依据参考文献[6]进行。

3）正交试验。在单因素试验的基础上进行正交试验，每个因素选取4个水平，以美拉德反应产物的A420 nm为考察指标，用方差分析的方法对结果进行处理，确定因素的主次顺序和最优水平以及最优组合。正交试验因素与水平见表1。

1.3.2 美拉德反应产物抗氧化性的测定 清除DPPH自由基的测定[7，8]。

取不同浓度（稀释倍数分别为10、25、50、100）的最佳反应条件下的美拉德反应产物样液3 mL于10 mL的比色管中，再加入3 mL的1×10-4 mol/L的DPPH溶液，混合后摇匀，于室温避光条件下静置30 min，用无水乙醇和水的混合液（体积比为1∶1）作参比，在517 nm处测吸光度。清除率按下式计算：

清除率=[1-（At-Ab）/Ac]×100%

式中，At为加入美拉德反应产物后DPPH溶液吸光度，Ab为美拉德反应产物与等体积无水乙醇的吸光度，Ac为未加美拉德反应产物的DPPH溶液吸光度（对照）。

1.3.3 美拉德反应产物的GC-MS分析 取10 mL的美拉德反应产物（最佳反应条件下的产物），放入125 mL的分液漏斗中，加入15 mL饱和NaCl溶液，然后用25 mL的乙醚萃取3次。每次10～15 min，合并3次萃取液，用无水硫酸钠干燥过夜，过滤后滤液倒入具有刻度的浓缩瓶里，常压浓缩至1 mL，然后进行GC-MS分析。

GC-MS分析条件：色谱柱：HP-5MS（60 m×250 μm i.d.×0.25 μm d.f.）弹性石英毛细管柱；程序升温：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至280 ℃，保持20 min；进样口温度：270 ℃；进样量：1.0 μL；分流比：5∶1；载气：氦气；流速：1 mL/min。检测器温度：270 ℃；溶剂延迟6.5 min，EI源电子能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；质量扫描范围：30～550 amu。采用NIST11标准谱库检索定性，峰面积归一化法定量。

2 结果与分析

2.1 美拉德反应条件的优化

2.1.1 美拉德反应单因素试验结果

1）反应温度对反应产物在卷烟中加香效果的影响。由表2可知，随着反应温度的升高，美拉德产物的增香效果逐渐变好。在选定的4个温度水平下，160 ℃下反应得到的产物增香效果较好，所以反应温度以160 ℃为宜。

2）反应时间对反应产物在卷烟中加香效果的影响。由表3可知，在2～4 h内，随着反应时间的延长，美拉德产物的增香效果逐渐变好，但当反应时间超过4 h以后，产物的增香效果反而下降，这可能是由于随着时间的延长，香味物质逐渐分解或者转化为其他的物质。综合来看，反应时间以4 h为宜。

3）初始pH对反应产物在卷烟中加香效果的影响。由表4可知，初始pH对美拉德反应产物在卷烟中的加香效果也有较大的影响。随着初始pH的升高，产物的加香效果逐渐增强，但当pH大于9时，产物的加香效果反而下降。因此，初始pH以9为宜。

4）山梨糖与羟脯氨酸摩尔比对反应产物在卷烟中加香效果的影响。由表5可知，山梨糖和羟脯氨酸摩尔比对美拉德反应产物在卷烟中的加香效果也有影响。随着山梨糖与羟脯氨酸摩尔比减小，美拉德反应产物在卷烟中的加香效果逐渐增强，但当其比例小于1∶2时，产物的加香效果出现下降，因此，山梨糖与羟脯氨酸的摩尔比以1∶2为宜。

2.1.2 美拉德反应的正交试验结果 各反应进行之后，各取1 mL美拉德反应产物体系溶于10 mL的去离子水中，以去离子水为参比，在T6新世纪紫外分光光度计上于420 nm波长下测定其吸光度[9-11]。吸光度的大小反映美拉德反应产物质量的好坏。在一定范围内，吸光度越大说明反应程度越深，反应速度越快，美拉德反应产物的质量越好。试验结果和方差分析分别见表6和表7。由表6和表7结果可知，各因素对美拉德反应产物的影响从大到小分别为反应温度、反应时间、山梨糖与羟脯氨酸摩尔比、初始pH。美拉德反应的最优条件组合为A4B4C2D3，即反应温度160 ℃，反应时间5 h，pH为8，山梨糖与羟脯氨酸摩尔比为1∶2。

2.2 美拉德反应产物抗氧化性能的测定

美拉德反应产物对DPPH自由基的清除率如表8所示。由表8可见，美拉德反应产物可以有效清除DPPH自由基，在一定的范围内随着其浓度的降低，清除DPPH自由基的能力也随之减弱。稀释25倍时，反应产物对DPPH自由基的清除率最高，达70.87%，说明美拉德反应产物对DPPH自由基的清除活性较高，是很好的抗氧化物质，这为其在卷烟中的应用提供了一定的理论基础。

2.3 美拉德反应产物的GC-MS分析

利用气质联用仪对山梨糖与羟脯氨酸的美拉德反应产物的醚溶性香味成分进行分离、鉴定，并利用面积归一化法测定了各种成分的含量，其结果见表9。由表9可知，反应产物共鉴定出11种成分。在鉴定出的11种成分中，主要为吡嗪、吡咯、吡啶等杂环化合物，这些物质是卷烟中的重要香气成分，但含量相对微弱，其中以吡嗪类物质的含量较高。吡嗪类物质产生烘烤香，可显著增加卷烟香气，同时降低其刺激性，在改善卷烟的感官品质方面有着重要的应用价值。

3 小结与讨论

本试验主要考察了反应温度、反应时间、初始pH、山梨糖与羟脯氨酸的摩尔比对美拉德反应产物加香效果的影响，确定了其较佳反应条件：反应温度160 ℃，反应时间5 h，pH为8，山梨糖与羟脯氨酸的摩尔比为1∶2，此条件下，反应产物的卷烟加香效果好；同时该产物可以有效清除DPPH自由基。

对反应产物进行GC-MS分析，检测到吡嗪、吡咯、吡啶等杂环化合物，这些物质是卷烟中的重要香气成分。在卷烟焦油含量降低的同时，致香成分也随之减少。美拉德反应可以产生烟草的重要香味成分，其产物可以减少烟草的涩度和苦味，起到增加香气、降低刺激性的作用。因此，美拉德反应值得进一步研究。

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