基于RhaD醛缩酶的“一锅四酶法”合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖

高雅慧，金则成，钱 超，李子杰，* ，中西秀树，高晓冬

(1.江南大学食品学院，江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

稀有糖是近年来国际上研究功能性甜味剂的一个热点，其定义为在自然界中存在但含量很低的单糖及其衍生物［1］。由于稀有糖在食用后产生能量较少且具有独特的功能和潜在的医疗价值，受到广泛关注［2－5］。在有机合成领域，醛缩酶催化的羟醛缩合反应已成为C－C键不对称合成必不可少的工具之一［6－8］。 磷 酸 二 羟 基 丙 酮 (dihydroxyacetone phosphate，DHAP)依赖型醛缩酶催化生成的产物具有两个新的立体中心［9］，其构型一般由醛缩酶决定，而不依赖于底物的结构或立体化学［10］。虽然利用该组酶类成功合成了许多常规化学法难以合成的糖类化合物［8－11］，然而专门用来合成稀有糖的研究还比较少。DHAP依赖型醛缩酶可接受多种醛作为受体，但对供体DHAP专一性很高［12］。由于DHAP价格昂贵且不稳定，限制了该酶类实际合成应用［12－14］。为避免使用昂贵且不稳定的底物DHAP，Fessner等首次建立了“一锅四酶法”［15］。作者前期结果表明 L－1－磷酸鼠李树胶糖醛缩酶(L－rhamnulose 1－phosphate aldolase，RhaD)可以接受D－甘油醛作为受体，但失去了对D－甘油醛的立体选择性，同时生成了两种稀有糖 D－山梨糖和 D－阿洛酮糖［16］(图1)。

图1 利用RhaD酶法合成D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.1 Enzymatic synthesis of D－sorbose and D－psicose with RhaD

在本研究中，为了降低反应成本，以更为便宜的底物DL－3－磷酸甘油代替L－3－磷酸甘油作为前体，采用“一锅四酶法”的方法对D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成进行了优化(图2)。在羟醛缩合反应中，酸性磷酸酶(acid phosphatase，AP)常用来脱掉缩合产物的磷酸基团得到目的产物，此外磷酸酶YqaB在中性pH下对多种磷酸糖具有较强的磷酸酶活性［17］。探索在“一锅四酶法”中用YqaB取代AP，可以减少酸碱及含盐废液的排放，代表了绿色食品的方向。

图2 利用RhaD合成D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.2 Synthesis of D－sorbose and D－psicose based on RhaD

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 由实验室构建并保藏的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a－ rhaD，E.coliBL21(DE3)/pET28a－yqaB 用来表达 RhaD 醛缩酶［16］和YqaB 磷酸酶［18］;DL－3－磷酸甘油、D－甘油醛、磷酸甘油氧化酶(glycerol phosphate oxidase，GPO)、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、D－山梨糖(D－sorbose)、D－阿洛酮糖(D－psicose)、茴香醛、Ca2+离子交换树脂Sigma－Aldrich;薄层色谱 (ThinLayer Chromatography，TLC)、硅胶铝板 60 F254、硅胶 60(200～400目) EMD Chemicals;Bio gel P－2胶、Aminex HPX－87H column(300mm ×7.8mm)Bio－Rad Laboratories;Pierce BCA蛋白浓度测定试剂盒及其他化学试剂 Thermo Scientific。

高效液相色谱仪 配有示差检测器，日本岛津公司;AKTAFPLC蛋白纯化系统 美国GE Healthcare公司;IS－971R型全温振荡培养箱 韩国Lab Companion公司;Eppendorf－5415D离心机 德国Eppendorf公司;J2－21型离心机 美国Beckman公司;Buchi旋转蒸发仪、恒温水浴锅 美国Fisher Scientific公司;真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 RhaD醛缩酶和YqaB磷酸酶的表达和纯化参照前期的工作［16，18］的方法。

1.2.2 D－阿洛酮糖和D－山梨糖的合成 以DL－3－磷酸甘油为前体“一锅四酶法”合成D－阿洛酮糖和D－山梨糖。

反应体系(10mL):DL－3－磷酸甘油(548.78mg，2.4mmol)，D－甘油醛(0.5mol/L 2mL，1mmol)，GPO(70U，2mg)，过氧化氢酶(1000U，1.18μL)，RhaD(272μL，终浓度0.5mg/mL)，补加无菌水使反应总体积为10mL。反应液在室温下轻摇反应16～22h，反应通过TLC来检测(展开剂为正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v∶v∶v))。反应终了后，向反应液中加入6mol/L HCl调pH为4.6，然后加入2μL AP(3U)，在37℃轻摇反应20～24h，用TLC来监测反应(展开剂为正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v∶v∶v)或乙酸乙酯∶异丙醇∶水 =9∶3∶1(v∶v∶v))。反应完全后，用1mol/L NaOH 将 pH 调整到7.0。为了避免使用酸和碱，当以YqaB代替AP脱磷酸基团时，无需调pH直接向反应液中加入YqaB(终浓度为0.25mg/mL)和MgCl2(终浓度为2.5mmol/L)，反应液在37℃，150r/min反应约12h。

1.2.3 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分离纯化参照文献［16］。

1.2.3.1 硅胶纯化 样品的前处理:向反应液中加入适量甲醇并离心除掉变性蛋白，将上清液转入到100mL的圆底烧瓶，在旋转蒸发仪上30℃下减压浓缩样品。当样品浓缩至5mL体积时，加入适量的硅胶，使上清液全部吸附到硅胶粉上并成粉末状后，结束旋蒸。装硅胶柱:将一根1.5cm×25cm玻璃柱子垂直固定于铁架台上。将1g硅胶粉加入约100mL的乙酸乙酯中，混匀后，一次性倒入柱子中，加压，使乙酸乙酯液面距离硅胶面约4cm。上样、纯化及浓缩:将吸附有样品的硅胶粉末小心地加入到硅胶柱，先用乙酸乙酯为流动相，去除一些非极性小分子，然后用流动相乙酸乙酯∶异丙醇∶水=9∶3∶1(体积比)进行洗脱并依次收集于试管中。按照先后顺序用毛细管吸取洗脱液，依次滴到硅胶铝板上，吹干，显色，先初步判定哪些试管中的洗脱液含有目的产物。然后再以D－山梨糖，D－阿洛酮糖为标准物，以乙酸乙酯∶异丙醇∶水=9∶3∶1(体积比)为展开剂，重新做TLC以进一步确定哪些洗脱液中含有目的产物。将含有目的产物的洗脱液合并，用旋转蒸发仪浓缩至1～2mL。

1.2.3.2 P－2凝胶排阻层析纯化 P－2填料的前处理与装柱:将一根1.5cm×90cm玻璃柱子垂直固定于铁架台上，加入脱气后的去离子水至高度约20cm关闭出水口。按照P－2凝胶的说明对填料进行预处理后，轻轻地混匀，先倒入适量的填料到柱子，使其沉积一定的高度后，打开出水口，并不断地加入填料，当胶面至合适高度时，用脱气后的去离子水平衡柱子过夜。上样与分离:关闭入水口，打开出水口，当液面降至胶面处时关闭出水口。将浓缩液(不超过2mL)小心均匀地加入到胶面上，当浓缩液完全进入到胶面内时，向柱床上方加入10mL去离子水并连通入水口，开始分离，并用自动收集器进行收集。用毛细管按顺序依次点样，吹干，显色，初步确定哪些试管中的收集液含有目的产物，然后以标准品为对照，重新做TLC和HPLC进行确定。将含有目的产物的洗脱液合并，用真空冷冻干燥机冻干，称重。

1.2.3.3 Ca2+离子交换树脂纯化 离子交换树脂的前处理:树脂用超纯水浸泡30min后，倾倒以除去一些悬浮物，重复两次。最后树脂用超纯水浸泡，轻轻混匀。装柱及分离:将带有夹套的玻璃柱子(26mm×100mm)垂直固定在铁架台上，关闭出水口，向柱子加入高度约20cm的超纯水，倒入混匀的树脂，待树脂沉积到高度约10cm，打开出水口并不断的加入树脂，待树脂高度距柱子的最上端约5cm时，装柱完成，打开超纯水的入水口，平衡柱子2h。将水浴锅加热，使水温为70℃，通过蠕动泵将水输入到夹套里，夹套的出水口通过管路重新流到水浴锅里，平衡30min后，准备上样。将冻干后的样品D－阿洛酮糖和D－山梨糖的混合物用5mL的去离子水溶解，均匀地加到胶面上，待样品液全部进入到柱床后，向胶面加入20mL去离子水后，打开入水口，开始分离纯化，流速约1.5mL/min，使用自动收集器进行收集。用毛细管按顺序依次点样，吹干，显色，初步确定哪些试管中的收集液含有目的产物，然后以标准品为对照，用TLC和HPLC进行确定，将含有D－山梨糖和D－阿洛酮糖的洗脱液分别合并，用真空冷冻干燥机冻干，称重，1H NMR鉴定。

1.2.4 TLC显色剂配制方法 18mL茴香醛溶于540mL 95%乙醇中，混匀置于冰水混合物上。将30mL 97%的硫酸与6mL乙酸混合得到混合酸，然后小心地将混和酸液逐滴加入到预冷的茴香醛乙醇溶液中并剧烈振荡，将得到的无色溶液－20℃保存。

1.2.5 HPLC流动相的配制及反应液中D－山梨糖和D－阿洛酮糖比例的测定 272μL H2SO4加到含有1L去离子水(18.2MΩ·cm)的2L烧杯中，混匀。将装配好的抽滤瓶连接到真空水泵，将流动相过滤脱气，得到浓度为5mmol/L的流动相。利用色谱柱HPX－87H(300mm×7.8mm，氢型阳离子交换树脂，填料为聚苯乙烯二乙烯苯树脂)来测定终反应液中D－山梨糖和D－阿洛酮糖的比例。吸取反应液100μL离心，上清液用HPLC进行检测。HPLC工作条件:5mmol/L H2SO4作为流动相，流速0.5mL/min，柱温箱温度60℃，示差检测器进行检测。采用相同的HPLC工作条件进行D－山梨糖和D－阿洛酮糖标准曲线的绘制。

2 结果与讨论

2.1 TLC检测以DL－3－磷酸甘油为前体的“一锅四酶法”反应

当反应体系未加AP，以DL－3－磷酸甘油为底物，产物1－磷酸酮糖的生成的TLC分析如图3－a所示，经过正丁醇∶乙酸∶水 =2∶1∶1(v/v/v)展开剂展层、茴香醛染液染色，能够检测到1－磷酸酮糖的生成并在TLC板上显示深靛蓝色;向反应体系中加入AP进行脱磷酸化反应后产物D－山梨糖和D－阿洛酮糖的生成如图3－b和图3－c所示。当用正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(v/v/v)展开剂展层以及茴香醛染液染色后，同未加入AP相比，反应液加入AP后，在D－山梨糖和D－阿洛酮糖的位置有新点生成，但D－山梨糖和D－阿洛酮糖的Rf值很接近，在该展层剂下很难将两者分开(图3－b);为了较好地将D－山梨糖和D－阿洛酮糖分离开来，使用展开剂乙酸乙酯∶异丙醇∶水=9∶3∶1(v/v/v)进行展层，经过茴香醛染液染色可以看到该展层剂可以很好地将D－山梨糖和D－阿洛酮糖分离开来并且反应液在D－山梨糖和D－阿洛酮糖的位置上有新点生成(图3－c)。

图3 TLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.3 TLC analysis of D－sorbose and D－psicose

2.2 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的HPLC检测及比例测定

为了进一步确定得到的产物为D－山梨糖和D－阿洛酮糖，反应液用HPLC进行检测，并用D－山梨糖和D－阿洛酮糖标准品作为对照。通过HPLC可以看出反应液在标准品D－山梨糖和D－阿洛酮糖的出峰位置都可以检测到相应的产物(图4)。为了计算这两种稀有糖的比例，配制不同浓度的D－山梨糖和D－阿洛酮糖标准品溶液，采用相同的HPLC检测条件，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，测得D－山梨糖/D阿洛酮糖比例约为1.2∶1。

2.3 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分离纯化

图4 HPLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.4 HPLC analysis of D－sorbose and D－psicose

将上述反应液经硅胶和P－2凝胶过滤纯化，两种单糖总的产率为39%(由于DL－3－磷酸甘油中所含有的L－3－磷酸甘油(1.2mmol)相对于D－甘油醛(1.0mmol)是过量的，转化率按照D－甘油醛的量来计算)。D－山梨糖和D－阿洛酮糖混合物可以通过Ca2+离子交换树脂进行分离，典型的分离曲线如图5所示［16］。经过Ca2+离子交换树脂进行进一步分离，分别得到纯的D－山梨糖和D－阿洛酮糖。

图5 D－山梨糖和D－阿洛酮糖的分离曲线Fig.5 Separation profile of D－sorbose and D－psicose with cation exchange resin

2.4 YqaB磷酸酶取代AP用于D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成

为了验证YqaB磷酸酶在“一锅四酶法”合成中的应用，反应液用HPLC进行检测，并以D－山梨糖和D－阿洛酮糖标准品作为对照。通过HPLC可以看出反应液在标准品D－山梨糖和D－阿洛酮糖的出峰位置都可以检测到相应的产物(图6)，从而表明YqaB可以实现脱磷酸化得到D－山梨糖和D－阿洛酮糖，并通过相同的方法测得D－山梨糖/D－阿洛酮糖的比例约为2∶3。通过硅胶纯化、P－2凝胶过滤层析，得到D－山梨糖和D－阿洛酮糖这两种单糖的混合物。由于在反应体系中，DL－3－磷酸甘油中L－3－磷酸甘油的量相对于D－甘油醛是过量的，根据D－甘油醛的量计算得到这两种单糖总的产率为36%。D－山梨糖和D－阿洛酮糖的混合物经过Ca2+离子交换树脂纯化，分别得到纯的D－山梨糖和D－阿洛酮糖。

2.5 纯化后的D－山梨糖和D－阿洛酮糖的1H NMR鉴定

为了鉴定经过Ca2+交换树脂分离得到的产物分别为D－山梨糖和D－阿洛酮糖，以D－山梨糖和D－阿洛酮糖的标准品作为对照，对产物进行1H NMR测定。由NMR比对结果可知，经过分离纯化后得到的产物为D－山梨糖和D－阿洛酮糖(图7)。

图6 HPLC分析D－山梨糖和D－阿洛酮糖Fig.6 HPLC analysis of D－sorbose and D－psicose

图7 纯化后的产物D－山梨糖和D－阿洛酮糖的1H NMR鉴定Fig.7 Characterization of the products D－sorbose and D－psicose after purification by1H NMR

3 结论

本研究在前期工作的基础上，为避免在羟醛缩合反应中直接使用昂贵且不稳定的底物DHAP，以便宜的底物DL－3－磷酸甘油作为前体物质，采用“一锅四酶法”的方法对D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成进行了优化，从而降低了反应成本。属于卤酸脱卤酶超家族的非专一性磷酸酶YqaB在中性pH下对多种磷酸糖具有较强的磷酸酶活性。为了避免在稀有糖的合成中使用酸和碱，以YqaB取代AP进行了D－山梨糖和D－阿洛酮糖的合成。本研究所采用的方法适用于其他DHAP依赖型醛缩酶，相信该方法的建立将为稀有糖及其衍生物的大量合成提供理论依据。

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