提高维生素C发酵中山梨醇转化率的自动控制补料方法研究

刘中敢　于霞　李静

摘要：维生素C生产中的重要一步是L-山梨糖发酵。该发酵采用细菌将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，分批发酵时，存在明显的底物抑制作用，因此很难获得高产率的山梨糖，而通过补料方式可消除底物抑制作用，改善山梨糖产率。本文在山梨糖发酵分批时采用了两种不同的补料方法：以0.6lh-1的恒定速率补入山梨醇含量为600gl-1的营养物，山梨糖的产率为12.64 gl-1h-1；以0.5-0.04lh-1的线性降低速率补入山梨醇含量为600gl-1的营养物，山梨糖的产率为17.01gl-1h-1。在产率方面后一种补料方式具有明显的优势，可以提高山梨糖产率，是较好的底物补料方法。

关键词：弱氧化醋酸杆菌 山梨醇 山梨糖 补料方法

中图分类号：TQ924 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0083-01

1 材料和方法

1.1 材料

70%山梨醇溶液，酵母粉，磷酸二氢胺，硫酸镁。

1.2 菌种及种子培养

菌种：NRRLB-72。

种子培养：培养48小时后的成熟斜面接种于试管，试管培养基装量为10ml，30℃静止培养72小时，接种于1L摇瓶，摇瓶培养基装量为100ml，控制温度在30℃，摇床转速250rpm条件下发酵培养。

1.3 发酵培养

1.3.1 发酵条件

发酵采用7.0L搅拌发酵罐，培养基配方如上，通气量2.2vvm，转速700rpm，培养温度30℃，pH通过加入3N HCl自动控制在6.0。

1.3.2 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1衡速补料分批发酵

发酵初始，体积为2.5L，山梨醇浓度为100gl-1 ，当生物量达4.2gl-1 时（对数生长期，约发酵8小时）开始以0.6lh-1衡速补入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培养基，为了排除其他影响，培养基中其余成分按山梨醇比例相应增加。补料结束后继续发酵至山梨醇完全耗尽。

1.3.3 补料速率线性降低分批发酵

发酵中补料速率线性降低：F=500.00-62.64×t（F单位是ml h-1，t单位是h）。发酵初始，体积为2.5L，山梨醇浓度为100gl-1 ，当生物量达3.8gl-1 时（约发酵6小时）开始补入2.0L含有600gl-1 山梨醇的培养基，为了排除其他影响，培养基中其余成分按山梨醇比例相应增加，补料速率线性降低（0.5-0.04lh-1）。补料结束后继续发酵至终点。

1.4 山梨糖总产率的计算

山梨糖总产率计算如下：产生的山梨糖（gl-1）/发酵周期（h）。

2 結果与讨论

2.1 600gl-1 山梨醇，0.6lh-1恒速补料分批发酵

0.6lh-1恒速补料对发酵的影响。此条件下发酵周期、生物量、山梨糖浓度分别为25小时、9.85、316.00gl-1 ，山梨糖总产率为12.16 gl-1 h-1。由于补料较快，导致发酵11.5小时时反应液中山梨醇浓度由10gl-1 突然增至210gl-1，不利于菌体的生长，这也可能是山梨糖产率降低的原因，此时后山梨糖产率一直较低16.5 gl-1 h-1 。因此，为了在高山梨糖浓度时依然获得高产率，需要改变补料速率使山梨醇浓度低于抑制水平。

2.2 补料速率线性降低的分批发酵

由于补料过快，使山梨醇浓度由10gl-1 突然累积到210gl-1，产生底物抑制作用，这样补料结束后，仍需要发酵一段时间。为了消除这一不利影响采取将补料速率线性降低（起始0.5lh-1）的方法。理论上，发酵与补料同时结束，有利于缩短发酵周期，提高山梨糖产率。

补料速率线性降低时的微生物生长和山梨醇、山梨糖浓度，发酵周期、生物量、山梨糖浓度分别为16小时、12.41、272.37gl-1，山梨糖总产率为17.01 gl-1 h-1 。

此补料方法与衡速补料相比，可以降低培养过程中山梨醇浓度（50-120 gl-1 ，6-13h；10-210 gl-1 ，8-11.5h）减弱对菌体生长的抑制作用（生物量12.41，9.85），补料结束后 再发酵时间也由13.5h降低到3h。实验结果表明补料速率线性降低是个好方法，可以提高山梨糖产率。

在分批发酵的补料策略方面，也有许多其他方面的报道，Bosjnak et等尝试采用梯度补料，山梨糖产率为11.62gl-1 h-1；Mori 等采用纯氧通气，提高山梨糖产率到44.85 gl-1 h-1，但不经济；Srivastava和Lasrado的补料发酵研究山梨糖产率为12.6gl-1 h-1。与这些研究结果相比，补料速率线性降低优势明显。

3 结语

在山梨糖补分批发酵中，山梨醇浓度为600 gl-1的培养基以0.6 l h-1衡速补料时，发酵周期25h，山梨糖产率及产量分别为12.64 gl-1 h-1和316.00gl-1；然而，以线性降低速率补料时，发酵周期16h，山梨糖产率及产量分别为17.01 gl-1 h-1和272.37gl-1。前者由于补料速度过快，使发酵液中山梨醇浓度处于抑制水平，延长了发酵周期，形成所谓“二次分批发酵”；而后者补料量呈线性递减，发酵液中山梨醇始终处于较适宜浓度，随着发酵进入恶化阶段，补入的山梨醇量也逐渐减少，这样使发酵达到最优化。

参考文献

[1] Lockwood LB. Ketogenic fermentation processes. In： Under-kofl er LA， Hickey RJ， editors. Industrial Fermentations. Chemi-cal Publishing Co， 1954：1-23.

[2] Boudrant J. Microbial processes for ascorbic acid biosynthesis： areview. Enzyme Microb Technol 1990；12：322–9.

[3] Damodaran M， Subramanian SS. Bacterial oxidation of sorbitolto sorbose. J Sci Ind Res 1951；5（10）：7–13.

[4] Bosjnak M， Pintar P， Gomercic K. Gradient fed-batch culture aseffi cient microbial oxidation method. Med Fac LandbouwwRijksuniv Gent 1991；56：1723–30.