白藜芦醇诱导前列腺癌细胞系PC-3凋亡的实验研究

郭　勇，田晓丽，范琼瑛，任秋霞，吴亚坤，苏军华*

(1.河北省石家庄市第一医院泌尿外科，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000；3.中国人民解放军白求恩国际和平医院脑内科，河北 石家庄 050082)



·论著·

白藜芦醇诱导前列腺癌细胞系PC-3凋亡的实验研究

郭勇1，田晓丽2，范琼瑛1，任秋霞3，吴亚坤2，苏军华2*

(1.河北省石家庄市第一医院泌尿外科，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000；3.中国人民解放军白求恩国际和平医院脑内科，河北 石家庄 050082)

[摘要]目的探讨白藜芦醇诱导前列腺癌细胞系PC-3细胞凋亡的作用。方法采用MTT比色法检测白藜芦醇对前列腺癌细胞系PC-3细胞的增殖抑制情况；采用流式细胞术检测前列腺癌细胞系PC-3细胞周期阻滞、诱导凋亡情况；采用RT-PCR法检测相关凋亡基因mRNA表达的情况。结果 B、C、D组PC-3细胞均有不同程度的抑制。24、48、72 h C、D组细胞生长抑制率高于B组，D组细胞生长抑制率高于C组(P<0.05)。B、C、D组48、72 h细胞生长抑制率高于24 h，72 h细胞生长抑制率高于48 h(P<0.05)。S期、G2/M期细胞比例明显下降,G0/G1期细胞比例明显上升, 且随药物浓度的增加，凋亡率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。C、D组PC-3细胞bcl-2表达水平低于A组，D组低于B组(P<0.05)；B、C、D组PC-3细胞bax表达水平高于A组，C、D组高于B组，D组高于C组(P<0.05)。结论白藜芦醇具有诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、阻滞细胞周期等作用，能达到很好的抗肿瘤效果，值得临床上广泛应用。

[关键词]前列腺癌;白藜芦醇;PC-3;细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.025

前列腺癌好发于老年男性，在我国发现时常为晚期，失去手术机会。由于目前没有彻底有效的治愈方法，因此研究新的治疗前列腺癌的方法显得尤为重要。白藜芦醇是从藜芦的根部分离而得，已发现在72种植物中可以获得。白藜芦醇的作用非常广泛，包括抗菌、免疫调节、抗癌、神经保护、心血管保护等多方面。在临床方面，白藜芦醇对多种恶性晚期肿瘤的治疗都有一定的效果[1-3]。本研究对白藜芦醇诱导前列腺癌细胞系PC-3凋亡的作用进行探讨，现报告如下。

1　资料与方法

1.1主要试剂与仪器 白藜芦醇(购自美国Sigma公司)，前列腺癌细胞系PC-3细胞(来自河北医科大学第二医院实验室)，RPMI1640培养液(Gibcobrl公司)，PCR提取及扩增试剂盒(购自Takara 公司)。Biorad凝胶成像分析系统(江苏捷达公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及白藜芦醇工作液配制将前列腺癌细胞系PC-3细胞接种于RPMI 1640培养基中(含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，培养液中含300 mg/L谷氨酰胺、10%新生牛血清，5%CO2培养箱为37 ℃饱和湿度温箱。每天更换培养液，待细胞培养约85%贴壁时，2 d传1代。白藜芦醇用双蒸水100%二甲基亚砜溶解后,灭菌，离心，取上清分别配制浓度为0.2、0.5、0.8 g/L白藜芦醇工作液，置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.2实验分组实验分为对照组(A组)和实验组(B、C、D组)。B组为加入浓度0.2 g/L白藜芦醇后的PC-3细胞，C组为加入浓度0.5 g/L白藜芦醇后的PC-3细胞，D组为加入浓度0.8 g/L白藜芦醇后的PC-3细胞。

1.2.3MTT比色法检测白藜芦醇对前列腺癌细胞系PC-3细胞的增殖抑制情况。取对数期人前列腺癌PC-3细胞株接种120孔板，每孔100 μL。A组接种10孔在37 ℃，5%CO2培养箱内常规培养24、48、72 h；B组接种30孔，其中10孔使药物作用24 h，10孔使药物作用48 h，10孔使药物作用72 h；C组接种30孔，其中10孔使药物作用24 h，10孔使药物作用48 h，10孔使药物作用72 h；D组接种30孔，其中10孔使药物作用24 h，10孔使药物作用48 h，10孔使药物作用72 h。24、48、72 h后每孔加入MTT 50 μL，孵育4 h后去除培养液 ,再加入二甲基亚砜100 μL，振荡10 min，使絮状物完全溶解。590 nm波长酶联免疫检测仪上分别测定吸光度(optical density，OD)值，实验重复3次，取均值，并计算细胞生长抑制率=(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/对照组平均OD值×100%。

1.2.4流式细胞术检查前列腺癌细胞系PC-3细胞周期阻滞、诱导凋亡情况。A、B、C、D 4组细胞各30孔，均采用70%冷乙醇固定,PBS液冲洗2次,过夜，之后用PBS液冲洗1次,加入RNA酶酶切、碘化丙啶染色后, 室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞周期,结果用细胞周期拟合软件Modfit分析，得出细胞凋亡比例及周期分布。G2/M阻滞用G2期细胞所占比率表示[4]。

1.2.5RT-PCR法检测相关凋亡基因mRNA的表达情况。经白藜芦醇作用24 h后，用胰蛋白酶适度消化、收集PC-3细胞, TRIzol法提取细胞总mRNA；NanoDrop(Thermo)联合琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。随后根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)所提供的方法对提取出的RNA进行反转录，反转录体系为20 μL。bax：sense 5′-TTTCTGACGGCAACTTCAACTG-3′, antisense 5′-CAACCACCCTGGTCTTGGAT-3′；bcl-2：sense 5′-CGCAGAGGGGCTACGAGT-3′, antisense 5′-GTTGACGCTCTCCACACACAT-3′。反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min。进行RT-PCR，反应后的PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳,用Biorad凝胶图像采集与分析系统进行扫描分析,用Chemi-Imager5500 软件测定OD值。

1.3统计学方法应用SPSS 13.0软件包进行数据处理。计量资料比较分别采用单因素方差分析和q检验；等级资料比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1细胞生长抑制率比较A组无细胞生长抑制，B、C、D组PC-3细胞均有不同程度的抑制。24、48、72 h C、D组细胞生长抑制率高于B组，D组细胞生长抑制率高于C组(P<0.05)。B、C、D组48、72 h细胞生长抑制率高于24 h，72 h细胞生长抑制率高于48 h(P<0.05)。随白藜芦醇浓度增加及时间的延长，PC-3细胞生长抑制率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1各组细胞生长抑制率比较

组别细胞生长抑制率24h48h72hFPA组000B组13.25±1.0228.64±3.12△36.84±3.15△▲207.8970.000C组21.92±2.34*41.28±6.23*△54.31±5.64*△▲104.7140.000D组32.85±3.14*#58.15±7.28*#△64.04±6.23*#△▲81.0260.000F176.72464.75970.75P0.0000.0000.000

*P<0.05与B组比较#P<0.05与C组比较△P<0.05与24 h比较▲P<0.05与48 h比较(q检验)

2.2细胞周期分布及诱导凋亡情况比较S期、G2/M期PC-3细胞比例明显下降,G0/G1期细胞比例明显上升；随药物浓度的增加，凋亡率明显上升,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2 。

表2　各组细胞周期分布及诱导凋亡情况比较　(n=30，例数，%)

*P<0.05与A组比较(秩和检验)

2.3凋亡相关基因表达比较4组bcl-2和bax差异有统计学意义(P<0.05)。C、D组PC-3细胞bcl-2表达水平低于A组，D组低于B组；B、C、D组的PC-3细胞bax表达水平高于A组，C、D组高于B组，D组高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3各组PC-3细胞bcl-2、bax蛋白表达水平比较

组别OD值bcl-2baxA组0.042±0.0020.035±0.004B组0.039±0.0030.041±0.003*C组0.037±0.003*0.052±0.004*#D组0.035±0.002*#0.061±0.003*#△F8.38479.144P0.0000.000

*P<0.05与A组比较#P<0.05与B组比较△P<0.05与C组比较(q检验)

3　讨　　论

前列腺癌是中老年男性发病率较高的肿瘤之一，是引起美国男性死亡的第二大癌症，而在我国前列腺癌发病率也在迅速增加[5-6]。由于前列腺癌的发病机制极其复杂，目前并无有效的药物能够根治。有研究证实，黄酮和多酚类化合物能够很好地预防、治疗前列腺癌[7]。

白藜芦醇属于多酚类化合物，具有广泛的生物学作用，如抗肿瘤、抑制血小板聚集、免疫调节作用、调节肿瘤相关酶、抗炎、心血管保护等[8]。此外，白藜芦醇还具有抗肝纤维化、治疗休克、抗衰老、抗氧化、减肥、美容等多种功效。临床大量研究均表明，在治疗如肝癌[9]、卵巢癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等多种晚期恶性肿瘤患者时，应用化疗药物联合白藜芦醇临床疗效显著。针对胃肠道等消化系统恶性肿瘤，白藜芦醇能抑制肿瘤增殖，可综合性多靶位地调节肿瘤细胞的各个层次的分子,起到调节平衡的作用[13-14]。还能抑制转移性前列腺癌细胞PC-3M-IE8增殖和减弱肿瘤侵袭能力。本研究结果显示，在前列腺癌系PC-3细胞中，加入0.8 g/L的白藜芦醇作用72 h后，PC-3细胞生长抑制率能达到(64.04±6.23)%。充分证实了白藜芦醇抑制细胞增殖的作用。

细胞凋亡是在多种基因调控下，细胞启动预定的凋亡程序，发生生理死亡的过程，又称程序性死亡，在细胞衰老、肿瘤的发生中起重要作用[15]。而诱导肿瘤细胞凋亡是抗癌药物的重要机制，也是治疗肿瘤的重要途径之一。细胞周期阻滞能抑制肿瘤细胞增殖且会诱导肿瘤细胞凋亡[16]，细胞G2/M期受到阻滞能阻止DNA受损伤的细胞进入有丝分裂，因此细胞G2/M期的阻滞是药物抗肿瘤机制的重要靶点。白藜芦醇能诱导前列腺癌细胞的凋亡，一定程度上能抑制肿瘤增殖，减慢肿瘤进展、转移。本研究结果显示，未加入白藜芦醇的PC-3细胞，G2/M期细胞比例为26.67%，加入0.8 g/L白藜芦醇的PC-3细胞，G2/M期细胞比例为6.67%，表明白藜芦醇具有显著的增殖抑制作用和抑制集落生长作用，能够抑制增殖和细胞周期阻滞；采用流式细胞术检测白藜芦醇诱导前列腺癌PC-3细胞是否进入G2/M阻滞，加入不同浓度白藜芦醇作用24 h后，S期、M期比例明显下降,G0/G1期细胞比例明显上升，表明白藜芦醇能降低DNA的合成,抑制肿瘤细胞增殖。

bax和bcl-2是bcl2家族中重要的调控凋亡的基因，细胞凋亡或增殖是由二者的相互作用决定的，其中bax促进细胞凋亡,bcl-2抑制细胞凋亡[17]。bax主要分布在细胞基质中，通过促进PT孔通道开放，使色素细胞C从线粒体释放入细胞质，从而激活caspase级联反应诱导细胞凋亡。bcl-2属于膜结合蛋白定位于线粒体的外膜中，一般以同源二聚体的形式存在，可以抑制细胞凋亡。本研究结果显示，白藜芦醇可以抑制基因(bax、bc1-2)的表达，而且随着浓度增加，抑制作用增强。表明白藜芦醇主要是使凋亡促进基因bax上调，同时使凋亡抑制基因bcl-2下调，进而使bcl-2/bax比值下降，最终达到诱导细胞凋亡的目的。

综上所述，白藜芦醇具有诱导前列腺癌细胞系PC-3细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制PC-3细胞基因的表达增殖等作用，高浓度的白藜芦醇的抑制作用更强，能达到很好的抗肿瘤作用，可能是抗前列腺癌的机制之一。白藜芦醇在人前列腺癌治疗中具有广阔的应用前景。

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(本文编辑：赵丽洁)

[收稿日期]2016-02-24；[修回日期]2016-07-04

[作者简介]郭勇(1976-)，男，河北石家庄人，河北省石家庄市第一医院副主任医师，医学学士，从事泌尿外科疾病诊治研究。 *通讯作者：E-mail:1120237924@qq.com

[中图分类号]R737.25

[文献标志码]B

[文章编号]1007-3205(2016)07-0838-04