镁离子对大鼠雪旺细胞增殖及NGF分泌的影响

李　明，宋永周，王　斌，童九辉，袁　鹤，马　维

(河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000)



·论著·

镁离子对大鼠雪旺细胞增殖及NGF分泌的影响

李明，宋永周，王斌，童九辉，袁鹤，马维*

(河北医科大学第二医院骨科，河北 石家庄 050000)

[摘要]目的观察镁离子对体外培养大鼠雪旺细胞(Schwann cells,SCs)增殖及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)分泌的影响。方法选取出生3～5 d SD大鼠，分离双侧坐骨神经行SCs体外培养，用S-100免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。取对数生长期SCs分别加入含不同浓度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)和10%FBS的DMEM培养基。分别于第2、4、6、8天，MTT法检测SCs增殖情况，ELISA法检测细胞分泌NGF水平。结果经双30 min差速贴壁法，可以去除大部分成纤维细胞。原代培养的SCs，接种24 h后即可贴壁生长。在培养的第72 h细胞胞体出现并肩平行排列的趋势，第7天可见细胞聚合。经免疫组织化学检测计数，培养6 d后的SCs，其纯度达到91%。各组SCs增殖活力均呈上升趋势(A组上升幅度最大，C组上升幅度最小)，各组分泌的NGF水平至第6天达峰值后均下降(A组上升幅度最大，C组上升幅度最小)，4组组间、不同时点间、组间·不同时点间交互作用差异有统计学意义(P<0.05)。 结论适宜浓度的MgCl2对体外培养大鼠SCs的增殖和分泌功能有促进作用。

[关键词]镁；雪旺细胞；神经生长因子；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.001

雪旺细胞(Schwann cells，SCs)是构成周围神经系统中特有的胶质细胞。不仅参与髓鞘的形成，还在周围神经损伤后，通过自身快速增殖、分裂以及分泌各种蛋白分子维护轴突的生长环境，促进神经的自我修复及再生。镁离子是细胞正常代谢所必需的离子之一，在细胞中含量丰富，在体内参与几百种酶反应。在局部微环境中，镁离子作为细胞第二信使具有调节线粒体钙缓冲能力，同时具有抗凋亡、抗氧化及抗炎作用，对于神经冲动的传导，也具有重要意义[1]。目前，对镁的研究多集中于对呼吸系统黏膜[2-3]和对神经系统的保护，镁离子对神经系统保护作用的研究大多集中于颅脑损伤及脊髓损伤[4-8]，而在外周神经损伤的研究较少。本研究通过体外培养大鼠SCs，观察镁离子对SCs的增殖及分泌功能的影响，旨在为构建适宜SCs培养的微环境提供一定实验依据和理论基础。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物选用出生3～5 d无特定病原体级SD大鼠20只，雌雄不限，体质量25～30 g，由河北省实验动物中心提供。实验进行前，经我院科研伦理委员会批准同意。

1.2试剂DMEM培养基(Sigma公司)，胎牛血清(fetal calf serum，FBS，Sigma公司)，胶原酶(Gibco公司)，S-100多克隆抗体(Boster公司)，神经生长因子(nerve growth factor,NGF)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(Boster公司)，免疫细胞化学试剂盒(Boster公司)，噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl- tetrazolium bromide,MTT,Sigma公司)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，美国R&D公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，氯化镁(Sigma-Aldrich公司)。

1.3SCs培养、纯化取出生3～5 d乳鼠双侧坐骨神经，剥离神经外膜后剪成小碎块，加入0．25%胰蛋白酶及1%胶原酶各1 mL，充分晃动，待消化液变浑浊后置于37 ℃空气摇床中振荡消化，在显微镜下观察到大部分组织块被消化成单细胞后，加入完全培养基终止消化，过滤消化液，1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入适量DMEM培养液，制成单细胞悬液，将其放入预先铺有多聚赖氨酸的培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养30 min，将消化液移至另1个培养瓶中，以双30 min 差速贴壁法贴走部分纤维母细胞。24 h后，加入终浓度为10-5mmol/L的阿糖胞苷，对成纤维细胞进行抑制，24 h后吸除含有阿糖胞苷的培养液，以后每隔2～3 d更换1次培养液，每日在倒置相差显微镜下观察其生长情况。待细胞融合约80%时进行传代。取第2代细胞爬片，行S-100免疫细胞化学鉴定。

1.4SCs鉴定取第2代细胞接种到预置有盖玻片的24孔培养板上，待细胞长成单层时，取出盖玻片，0.1 mol/L PBS冲洗，冷丙酮固定20 min，0.1%Triton-X100 浸泡8 min，加入5%BAS 封闭液，室温下孵育25 min，滴加S-100 一抗(1∶100比例稀释)，在37 ℃湿盒中孵育1 h，再滴加辣根酶标记二抗(1∶100比例稀释)，37 ℃湿盒中孵育30 min，再次0.1 mol/L PBS 液充分冲洗， DAB 显色，自来水冲洗10 min，常规脱水，透明，封片，镜检。

1.5MTT比色检测SCs活性实验分为4组，即正常培养组和A、B、C组，培养基分别为含不同浓度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)的含10%FBS的DMEM培养基。取对数生长期的第3代SCs悬液，以1×104/mL密度接种于96孔培养板中，每孔200 μL，于5%CO2、37 ℃培养箱培养24 h。培养基用含不同浓度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)含10%FBS的DMEM维持液置换原培养基。每组各6个复孔，于第2、4、6、8天取出待测样品，每孔加入MTT(5 g/L) 20 μL，避光孵育4 h，收获细胞弃除培养液，并加入150 μL DMSO终止溶液，振荡10 min以充分溶解结晶，置于酶标仪上，490 nm波长下测各孔光吸收值。

1.6ELISA检测SCs分泌NGF水平取对数生长期的第3代SCs，以1×105/mL密度接种于涂有多聚赖氨酸的24孔培养板中，共4组，每组6孔。于5%CO2、37 ℃培养箱培养24 h后，用含不同浓度MgCl2(0、0.5、1、2 mmol/L)的含10%FBS的DMEM维持液置换原培养基。培养第2、4、6、8天取各组上清液离心，将上清液移入无菌EP管中，再次离心，将上清液分别移入另1个EP管中，-20 ℃冷藏待测。待全部样品收集后，按照试剂盒使用说明测定培养液上清标本，以及NGF标准品的吸光度值，根据样品OD值在NGF含量标准曲线图上查出相应NGF含量。

2　结　　果

2.1SCs培养经双30 min差速贴壁法，可以去除大部分成纤维细胞。原代培养的SCs，一般在接种24 h后即可贴壁生长，胞核呈长形或卵圆形，胞体的立体感强，形态饱满呈梭状，周边有明显的光晕，两端有细长的突起，通常呈双级状。随着培养时间的延长，从胞体伸出的突起逐渐增长。在培养的第72 h，即可观察到细胞胞体出现并肩平行排列的趋势，第7天在显微镜下可见细胞聚合，呈“端对端，肩并肩”等旋涡排列或网状排列，逐渐形成片状，形如地毯(图1)。

2.2免疫细胞化学结果SCs对抗S-100蛋白呈阳性反应，胞体呈细小梭形，边界清晰，两端有数量不等的突起，排列成栅栏状或网状。胞核比胞浆着色浅，胞浆着色为棕色。对胞浆为棕色的阳性细胞进行计数，培养6 d后的SCs，其纯度达到91%(图2)。

2.3不同浓度MgCl2对SCs增殖的影响在培养后的第2、4、6、8天不同时间点，正常培养组和C组OD值呈先升高再降低趋势，第6天达高峰，第8天有所回落；A、B组OD值呈升高趋势；A组上升幅度最大，C组上升幅度最小；4组组间、不同时点间、组间·不同时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1原代培养第7天的细胞形态(×200)

Figure 1The cell morphology on the seventh day of primary culture(×200)

图2雪旺细胞S-100免疫细胞化学观察(免疫组织化学 ×200)

Figure 2S-100 immunocytochemical image of schwann cells(Immunohistochemistry ×200)

表1　不同浓度MgCl2对SCs增殖活力比较Table 1　Comparison of the proliferation activity of SCs in different concentrations of MgCl2　值)

2.4不同浓度MgCl2对SCs分泌NGF水平的影响4组在培养后不同时间点NGF分泌数值呈先升高再降低趋势，第6天达到峰值，第8天有所下降；A组上升幅度最大，C组上升幅度最小；4组组间、不同时点间、组间·不同时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2各组SCs分泌NGF含量比较

组别 培养时间第2天第4天第6天第8天正常培养组 45.356±3.12172.464±6.90375.260±5.14471.672±2.882A组 43.534±6.05474.094±5.24790.085±2.43584.744±7.515B组 42.778±1.15074.490±2.64676.944±3.58274.060±6.583C组 40.194±1.35250.351±2.77265.533±8.34759.192±4.424组间 F=272.141 P=0.000不同时点间 F=739.632 P=0.000组间·不同时点间 F=24.197 P=0.000

3　讨　　论

SCs是周围神经系统中重要的胶质细胞，不仅参与髓鞘的形成，而且对于神经的修复和轴突再生均具有重要作用。在周围神经损伤后的再生修复过程中，SCs通过吞噬轴突碎片，支持引导再生纤维生长，分泌多种NGF，促进轴突向远端生长，同时产生细胞外基质和细胞黏附分子，防止受损神经元胞体的死亡[9]。在本研究中，通过酶消化法和差速贴壁法进行纯化，再利用阿糖胞苷清除残留的成纤维细胞，因此获得了较高纯度的SCs。在周围神经系统中，只有成熟的SCs可以强烈表达S-100 蛋白，所以用S-100 抗体鉴定SCs是非常可靠的[10]。本研究应用免疫组织化学染色方法，观察到培养细胞的胞浆着色为棕色。通过对阳性细胞计数，培养6 d后的SCs，其纯度达到了91%，证明通过酶消化法和差速贴壁法体外培养SCs是成功的。

镁在细胞中含量丰富，是人体内必不可少的微量元素之一。镁在体内参与几百种酶反应，对维持细胞膜的完整性、细胞呼吸、蛋白质合成、糖和能量代谢、Na+-K+正常交换等均具有重要作用。一般认为，镁离子可通过对细胞功能的调节作用、N-甲基-D-天冬氨酸受体的拮抗作用、钙离子拮抗作用等发挥神经保护作用[11]。李伯翰等[1]用镁金属纤维丝与SCs共培养，发现镁离子在微环境下可以促进细胞组织的黏附以及分泌生长因子NGF作用。适宜浓度的镁离子对SCs增殖有促进作用，同时对于SCs合成和分泌NGF也有促进作用。鄢开胜等[12]研究发现，对体外培养的螺旋神经节细胞预先给予1 mmol/L MgCl2能增加暴露于谷氨酸的螺旋神经节细胞的存活率，还能通过抑制钙离子内流降低谷氨酸对螺旋神经节细胞的毒性，对螺旋神经节细胞损伤发挥保护作用。饮食中加入适量镁能降低大鼠对噪声暴露后的敏感性。对噪声性听力损失有防护作用[13]。吕一鸣等[14]观察不同浓度镁离子对成纤维细胞和成骨细胞的生长情况，结果发现成纤维细胞最适镁离子生存的浓度为70 mmol/L，成骨细胞为30 mmol/L。

周围神经损伤后，SCs分泌大量的内源性神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)，包括NGF、脑源性神经营养因子、睫状神经生长因子3大类。其中NGF对于周围神经的修复起到了主要的促进作用，它可以诱导神经元突起生长，防止神经元变性凋亡，促进损伤神经再生及修复[15]。姚健等[16]在进行神经元体外培养时发现，神经元单独培养时，若去除NGF培养液，其轴突出现漂浮，神经元最后死亡，然而将神经元与SCs共同培养时，即使去除NGF，神经元依然良性生长，SCs也出现明显增殖，并包裹轴突。另有研究表明对大鼠坐骨神经切断处局部给予NGF，能明显改善神经移植术后的功能恢复[17]。

研究表明，镁离子对体外培养的大脑神经元具有保护作用，但这种保护作用并不是浓度依赖性的。鄢开胜等[12]发现，镁离子浓度过高，对体外培养的螺旋神经节细胞保护作用反而降低，原因可能是浓度过高对钙离子通道有抑制作用[18]。本研究观察了含0.5、1、2 mmol/L MgCl2的培养基与正常培养基对SCs增殖及NGF分泌水平的影响，结果发现0.5 mmol/L MgCl2有促进作用，2 mmol/L MgCl2对SCs增殖及NGF分泌水平有抑制作用。关于MgCl2对细胞保护及其增殖促进作用的适宜浓度，目前尚无明确的文献报道，先前发表的研究结果并不一致，可能是所培养的细胞及培养条件不同所致[19-22]。镁离子如何促进SCs的增殖及分泌，其具体机制仍需进行深入的研究。

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(本文编辑：赵丽洁)

[收稿日期]2016-05-04；[修回日期]2016-05-23

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(ZL20140291)

[作者简介]李明(1980-)，男，河北隆尧人，河北医科大学第二医院主治医师，医学博士，从事骨科疾病诊治研究。 *通讯作者。E-mail：15803210539@163.com

[中图分类号]R329.26

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)07-0745-05

Effect of magnesium on proliferation and NGF secretion in Schwann cells of rat

LI Ming, SONG Yong-zhou, WANG Bin, TONG Jiu-hui, YUAN He, MA Wei*

(Department of Orthopedics, the Second Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of magnesium on proliferation and nerve growth factor(NGF) secretion in Schwann cells(SCs). Methods3～5 days old SD rats were used. The SCs were isolated from sciatic nerves in vitro. The positive cells were counted by using S-100 immunocytochemical staining. SCs were divided into four groups. The culture medium was DMEM containing 10% FBS and different concentrations of MgCl2(0， 0.5， 1， 2 mmol/L). MTT was used to detect the cell proliferation of the Schwann cells at 2, 4, 6, 8 d .The expression of NGF was detected by ELISA. ResultsMost collagenoblast were removed by differential adhesion about 30 minutes. The primary-cultured SCs were adherent to the plastic surface of the cell culture dish and growed 24 h after inoculation. In the 72th hour of cultivation, the cells showed the trend of parallel arrangement. In the 7th day, we could see cell aggregation under a microscope. Through counting by immunohistochemistry test, the purity of SCs reached 91% 6 days after cultivation. The purity of SCs was 91% by S-100 immunocytochemical staining. Compared with normal training group, 0.5 mmol/L MgCl2 group had a promoting effect on SCs proliferation and NGF secretion. There were significant differences in 4 groups, in different time points, and in the interaction of the groups vs time points(P<0.05). ConclusionAppropriate concentration of MgCl2 can stimulate the proliferation and NGF secretion of SCs of rat.

[Key words]magnesium； Schwann cells； nerve growth factor； rats