响应面法对黑果枸杞中花青素测定条件的优化

杜丽娟，汪庆平，邵金良，王　丽，刘兴勇，和丽忠

(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，昆明　650223)



响应面法对黑果枸杞中花青素测定条件的优化

杜丽娟，汪庆平，邵金良，王丽，刘兴勇，和丽忠

(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，昆明650223)

摘要：以黑果枸杞为原料，采用pH示差法，通过响应面法优化花青素含量的测定条件。通过单因素试验和Box-Behnken Design试验研究乙醇体积分数、pH 1.0缓冲液平衡时间、pH 4.5缓冲液平衡时间等3个变量对黑果枸杞中花青素响应值的影响程度。根据响应面的最优化分析，得出最佳条件是：用80%酸性乙醇溶液，超声萃取30min，取花青素提取液在pH 1.0和pH 4.5的缓冲液中各平衡80min，在最适波长处测定。通过试验验证，采用pH示差法，通过响应面法优化得到的黑果枸杞中花青素含量的测定条件，可靠准确、具有实用价值。

关键词：黑果枸杞；花青素；响应面；pH示差法

花青素属于类黄酮化合物，主要存在于花卉、果实及有色叶片中，是主要的呈色物质。花青素种类繁多，迄今为止在自然界中发现的花青素已经超过650种，已知的有20多种，在植物中最常见的有天竺葵色素(Pg)、矢车菊色素(Cy)、飞燕草色素(Dp)、芍药色素(Pn)、牵牛花色素(Pt)和锦葵色素(Mv)。游离的花青素在自然状态下不稳定，常与糖键合成花色苷，以糖苷的形式存在于表皮细胞的液包内。花青素呈色反应差异决定于R1、R2取代基的不同，从而使植物的花、果实等呈现出多种色彩(蓝色、红色、紫色等)。花青素属于天然色素，安全、资源丰富，易提取，有着巨大的应用潜力，具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能，成为目前天然产物、有机化学和生物化学研究的热点和焦点之一[1-5]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)为茄科枸杞属的多年生耐盐、抗旱植物，果实成熟后为紫黑色，资源量丰富。其成熟果实含一定量的人体必需脂肪酸、生物碱、酚类、蛋白质、维生素、氨基酸、微量元素、还原多糖及丰富的花青素[2，6-7]。本文针对黑果枸杞，对用pH示差法测定黑果枸杞中花青素含量的条件进行了优化和讨论，从而建立了适合黑果枸杞中花青素含量测定准确可行的方法，为其花青素的开发利用提供条件。

1材料、试剂及仪器

材料：黑果枸杞。

试剂：盐酸，氯化钾，乙酸，乙酸钠，乙醇等试验用试剂均为分析纯。

仪器：分析天平，超声仪，pH计，离心机，紫外-可见分光光度计。

2试验方法

2.1试剂配制

pH=1.0缓冲液：0.02mol/L的KCl溶液(1.49g定容至100mL)与0.2mol/L的HCl溶液(1.7mL定容至100mL)按6：5混合，调pH=1.0。

pH=4.5缓冲液：19.294g NaAc加16mL冰醋酸，定容至500mL，调pH=4.5。

80%的酸性乙醇溶液：80mL无水乙醇加20mL水，盐酸调pH=1.0。

2.2花青素提取液的制备及测定

2.2.1花青素提取液的制备

称取10g新鲜样品，加入80%的酸性乙醇溶液超声萃取30min，重复提取3次，合并提取液到100mL，10 000r/min离心5min，取上清液，得到花青素提取液。

2.2.2花青素的测定

取10mL花青素提取液，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液定容至100mL，平衡80min，在最适波长处测定其吸光值。

2.2.3花青素的计算公式

花青素的计算公式如(1)式。

(1)

(1)式中，X：花青素的含量(mg/g)；A：吸光值，= pH 1.0～4.5(最大波长的吸光值)；M：矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900；F：稀释倍数；V：样液终体积(mL)；m：称样量(g)。

2.3单因素试验

2.3.1最适提取剂的确定选取不同的有机溶剂(如无水乙醇、甲醇、丙酮等)，加入适量的有机酸或无机酸(如盐酸、乙酸、柠檬酸等)，使提取剂呈酸性，再对样品进行制备和测定，以确定最适提取剂。

2.3.2最适测定波长的确定将样品提取液分别用pH 1.0和pH 4.5缓冲液稀释5倍，用分光光度计在400～600nm进行光谱扫描，确定最大吸收光差值所在波长。

2.3.3缓冲液最适平衡时间的确定取花青素提取液，分别加入同体积的pH1.0和pH4.5缓冲液，摇匀，每20min测定1次吸光值，确定最适平衡时间。

2.4响应面试验

结合单因素试验结果，选取乙醇体积分数、pH1.0和pH4.5缓冲液的平衡时间，应用SAS软件中的中心组合试验(Box-Benhnken)，利用响应优化面法对黑果枸杞中花青素含量的测定条件进行优化(表1)。

表1　响应面分析因素与水平

3结果与分析

3.1单因素试验

3.1.1最适提取剂的确定试验以黑果枸杞鲜果作为提取原料。对所选的提取溶剂来说，既要对有效成分有较大的溶解度，又要避免其溶解大量的其他杂质，还要考虑所选溶剂的成本、环境污染、回收、安全性及工艺过程等很多的因素[1，8]。

花青素含多个羟基，具有很强的极性，所以提取剂一般选用甲醇、乙醇、丙酮。由于乙醇对提取材料中的蛋白质、多糖等的溶解度较低，既可减轻杂质处理负担，也可提高色素质量，且考虑到甲醇和丙酮的毒性较乙醇强，故使用乙醇做提取剂。此外，花青素在化学结构上都含有一个基本的C6 (A环)-C3 (C环)-C6 (B环)的碳骨架，所具有的8个共轭双键所形成的生色团带有正电荷，在酸性条件(pH≤3.0)下稳定，保护非羟基化的花青素不被降解，故本研究中使用酸性乙醇做提取剂(盐酸调pH≤3.0)，提取黑果枸杞中的花青素。若要获得更接近于天然状态的花青素，可采用中性溶剂或弱有机酸做初步提取，如柠檬酸、酒石酸等[2，3，9-14]。

3.1.2最适测定波长的确定将样品的花青素提取液分别用pH 1.0和pH 4.5缓冲液稀释5倍，用分光光度计在400～600nm进行光谱扫描，扫描图谱见图1。

图1　两种不同缓冲液的扫描

pH值对花青素的稳定性影响较大，花青素在溶液介质中是以4种可互变的形式平衡存在的，当其所处溶液介质的pH值发生变化时，会引起这种平衡的改变，而偏向某一种形式，从而导致所表现出的色泽和颜色强度发生变化。花青素在强酸性溶液中呈稳定的红色、弱酸性至中性溶液中呈红紫色、碱性溶液中呈蓝色，需通过试验确定两个对花青素吸光度差别最大，且对其稳定的pH，一般选择pH 1.0和pH4.5。在pH 1.0和pH 4.5缓冲液环境下的吸光度最大差值出现在525nm处(图2)，当pH=1.0时该处有最大吸收峰，而当pH=4.5时花色素转化为无色查尔酮形式，在该处无吸收峰，且最大差值能够最真实地反映出样品中的花青素含量。因此，应选用525nm作为最适测定波长[3，9，10]。

3.1.3缓冲液最适平衡时间的确定取花青素提取液，分别加入同体积的pH 1.0和pH 4.5缓冲液，摇匀，每20min测定一次吸光值，计算不同平衡时间下花青素的含量(mg/g)。

花青素在缓冲液中的结构为多种结构的动态平衡，当pH发生改变时，动态平衡也随之变化，而缓冲液平衡体系需要一定时间后才能稳定，故需要在使用缓冲液稀释之后，稳定一段时间，才能测定吸光值[10]。从图2可以看出，随着在缓冲液中的平衡时间的延长，花青素含量呈上升趋势，在平衡80min后上升趋势变缓趋于稳定，所以选择平衡时间为80min。

图2　在缓冲液中不同平衡时间下的花青素含量

3.2响应面试验

以黑果枸杞花青素含量为响应值Y进行响应优化试验，15个试验点中分析因点自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点(表2)。零点试验重复3次，用以估计试验误差[15，16]。利用SAS对所得数据进行分析，回归分析结果见表3。响应因子经回归拟合，解得回归方程为：Y= 4.823 333 + 0.233 75*X1+ 0.436 25*X2+ 0.247 5*X3-0.447 917*X1*X1-0.2125*X1*X2-0.155*X1*X3-0.6479 17*X2*X2-0.205*X2*X3-0.770 417*X3*X3。决定系数为R2=0.9425，说明模型的拟合度很好，响应值的94.25%的是由于所选变量引起；模型P为0.012 778(P<0.05)，表明该二次方程模型显著，可以用回归模型对响应值Y(黑果枸杞花青素的含量)进行预测；失拟项为0.112 4(P>0.05)，不显著，表明所选模型试验结果适合；一次项的X2和二次项的X1*X1、X2*X2、X3*X3显著，说明其对花青素含量的测定影响大，且对花青素含量(Y)影响大小顺序为：X2>X3>X1，即pH 1.0平衡时间>pH 4.5平衡时间>乙醇浓度。

表2　响应面分析试验与结果

表3　二次响应面回归模型方差分析

图3　Y=f(X1，X2)的响应面和等高线

图4　Y=f(X1，X3)的响应面和等高线

图5　Y=f(X2，X3)的响应面和等高线

从图3可以看出，X1的曲面变化幅度低于X2的曲面变化幅度，说明pH 1.0缓冲液平衡时间对花青素含量的测定影响较大。随着X1和 X2由低到高变化，花青素的含量由低到高，并趋于平缓。从图4可以看出，X1的曲面变化幅度低于X3的曲面变化幅度，说明pH 4.5缓冲液平衡时间对花青素含量的测定影响较大。随着X1由低到高变化，花青素的含量由低到高，并趋于平缓；而X3较高或较低时，花青素的含量都较低。从图5可以看出，X3的曲面变化幅度低于X2的曲面变化幅度，说明pH 1.0缓冲液平衡时间对花青素含量的测定影响较大。随着X2由低到高变化，花青素的含量由低到高，并趋于平缓；而X3较高或较低时，花青素的含量都较低。

综上，从因素交互作用的响应面图和等高线图(图3～5)可以看出，3个响应面均为开口向下的凸行曲线，说明响应值Y存在极大值，即黑果枸杞中花青素含量测定的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内[15，16]。因此据SAS软件中Box-Benhnken的中心组合试验进行参数的最优化分析，可以得出黑果枸杞中花青素含量测定的最优化条件：乙醇浓度80%，pH 1.0缓冲液平衡时间80min，pH 4.5缓冲液平衡时间80min。采用响应面法对试验数据进行回归分析及优化参数能很好地预测花青素含量测定的最优条件，具有一定的可靠性和参考价值。

根据上述最优化条件进行验证试验，即乙醇浓度80%，pH 1.0缓冲液平衡时间80min，pH 4.5缓冲液平衡时间80min，在此条件下进行3次平行试验，黑果枸杞中花青素含量为4.73mg/kg(n=3，RSD=0.96%)。与理论预测值相比，其相对误差约为0.09mg/kg，且重复性也很好，说明优化结果可靠。

4结论

用SAS 软件对黑果枸杞中花青素含量的测定建立了多元回归模型， 考察了乙醇浓度、 pH 1.0缓冲液平衡时间、pH 4.5缓冲液平衡时间，3个因素对黑果枸杞中花青素含量测定的影响程度。在本试验中，这3个因素对花青素的影响大小依次是：pH 1.0平衡时间>pH 4.5平衡时间>乙醇浓度。

根据SAS软件中 Box-Benhnken 的中心组合试验进行参数的最优化分析， 试验确定了提取花青素的最佳测定条件：乙醇浓度80%，pH 1.0缓冲液平衡时间80min，pH 4.5缓冲液平衡时间80min。采用响应面法优化得到的黑果枸杞中花青素含量的测定条件，可靠准确，具有实用价值。◇

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(责任编辑李燕妮)

基金项目：云南省科技惠民专项(农业)重点项目(项目编号：2014RA054)；云南省科技创新平台建设计划(公共科技服务)项目(项目编号：2014DA001)。

作者简介：杜丽娟(1981—)，女，硕士，助理研究员，研究方向：农产品品质分析和质量安全评价等。

通讯作者：和丽忠(1963—)，男，硕士，研究员，研究方向：农产品品质分析和质量安全评价等。

Optimization on Testing Conditions of Anthocyanins in Lycium ruthenicum by Response Surface Methodology

DU Li-juan，WANG Qing-ping，SHAO Jin-liang，WANG Li，LIU Xing-yong，HE Li-zhong

(Institute of Agriculture Quality Standards & Testing Technique，Yunnan Academy of Agricultural Science，Kunming 650223，China)

Abstract：This paper applied response surface methodology to optimize the technological parameters of anthocyanidin in Lyceum ruthenicum and studied the influences of ethanol’s volume fraction，pH 1.0 buffer’s balancing time and pH 4.5 buffer’s balancing time on the response value of anthocyanidin in Lyceum ruthenicum through single factor tests and Box-Behnken Design.The results showed that the optimum parameters were acid alcohol of 80%，pH 1.0 buffer’s balancing time and pH 4.5 buffer’s balancing time were 80 min.Under the optimum conditions， pH-differential method was used to determine anthocyanidin.The research technique was reliable and convenient.

Keywords：Lycium ruthenicum;anthocyanin;response surface methodology;pH-differential method