二十二碳六烯酸治疗糖尿病白内障病变的MEK通路机制

阳　辉　张新芳　冉瑞金

(湖北民族学院科技学院，湖北　恩施　445000)



二十二碳六烯酸治疗糖尿病白内障病变的MEK通路机制

阳辉张新芳1冉瑞金1

(湖北民族学院科技学院，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)治疗糖尿病(DM)白内障病变的MEK通路机制。方法小剂量链脲佐菌素(STZ)合并高糖高脂饮食复制DM大鼠白内障病理模型，对照组大鼠尾静脉注射生理盐水，DHA组大鼠尾静脉注射DHA。分析大鼠晶状体状态及胰岛素抵抗系数(HOMA-IR)的变化，检测大鼠晶状体组织MEK信号通路Ras、Raf、MEK及ERK1/2蛋白的表达。结果DM白内障大鼠组晶状体浑浊，HOMA-IR升高(P<0.01)，Ras、Raf、MEK及ERK1/2明显升高(P<0.01)，细胞凋亡分子Caspase3及Caspase9水平也明显上升(P<0.01)，而DHA组大鼠上述指标的异常得到明显改善(P<0.01)。结论DHA能够有效缓解DM白内障大鼠症状，且其作用机制可能与抑制MEK信号转导通路激活相关。

〔关键词〕糖尿病白内障；二十二碳六烯酸；MEK信号通路；胰岛素抵抗

白内障是糖尿病(DM)的主要并发症之一，严重影响患者的视力，并可能导致失明〔1，2〕。但是，目前关于DM白内障发病的确切分子机制尚不明确。MEK信号转导通路是细胞外信号向细胞内转导并引起核转录因子激活的关键信号通路，参与了多种DM并发症的发生及发展过程〔3，4〕。本研究旨在探讨抗氧化剂二十二碳六烯酸(DHA)治疗DM白内障病变的MEK通路机制。

1材料与方法

1.1动物及试剂清洁级雄性SD大鼠，体重200～230 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司〔许可号SCXK(京)2014-0004〕。基础饲料和高糖高脂饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。高糖高脂饲料配方：59.2%基础饲料、胆固醇2.5%、蔗糖20.0%、胆酸钠0.3%、猪油18.0%。

链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma Aldrich公司；血糖仪为罗氏Accu-Check Performa产品；葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司；mRNA提取及逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；SYBR Premix Ex Taq购自北京天根生物工程有限公司；荧光定量PCR仪ABI7700购自美国ABI公司；引物由上海生工生物有限公司协助合成；MEK及ERK1/2单克隆抗体购自Santa Cruz公司；Ras及Raf单克隆抗体购自Abcam公司；二抗及显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2动物分组50只SD大鼠随机分为对照组、DM白内障组、DHA低剂量组(1 μmol/L)、中剂量组(50 μmol/L)和高剂量组(100 μmol/L)，每组10只。小剂量STZ合并高糖高脂饮食复制DM白内障模型，对照组和DM白内障组大鼠给予生理盐水治疗，DHA组分别给予对应剂量的DHA灌胃治疗。12 w后颈动脉放血处死动物，分离晶状体于液氮中保存待用。

1.3荧光定量PCR检测相关蛋白表达mRNA制备及cDNA的逆转录过程均按照说明书进行。荧光定量PCR 的反应条件：95℃ 10 min；94℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，收集荧光，共 30个循环。反应体系为20 μl：cDNA 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，2.5×SYBR Green(TianGen)8 μl，超纯水9 μl。引物序列：β-actin正义：5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'，反义：5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3'；MEK正义：5'- GGAAAGTGGCACAGCTTGCT -3'，反义：5'-CTGGTCAGGCGCTCGATT -3'；Ras正义：5'-GGATTTGATGCCTTGGGAGTCAGAC-3'，反义：5'-ATTTTTTTCTTTGGAGTCAGTCCAT-3'；Raf正义：5'-AAGATGGTACAGTGGACGGC-3'，反义：5'-CCGTGTTCCTGGTGAAATCT-3'；ERK1正义：5'-TCCTTTGGATCTGGTCCTG-3'，反义：5'-CCCCAGCAAGTGAGAGAAG-3'；ERK2正义：5'-AAGAGGTTGTTCCAAATGC-3'，反义：5'-AGAGGCACCATTCACTGAC-3'。

1.4免疫印迹法各组大鼠晶状体组织分离后在冰水浴中充分匀浆，进行总蛋白定量后以等量总蛋白进行垂直SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝移动到凝胶底部时停止电泳，采用半干法进行转膜。转至PVDF膜上后5%BSA在室温条件下封闭2 h。然后与一抗(稀释比1∶200)4℃温孵杂交，然后用无菌PBS漂洗3次，与二抗室温杂交2 h。硝酸纤维素膜用PBS漂洗后进行显影、定影。以β-actin作为内参进行蛋白表达定量分析。

1.5统计学方法应用SPSS13.0软件进行方差分析、SNK或Dunnett法检验。

2结果

2.1DM白内障大鼠空腹胰岛素(FINS)及DHA干预作用分析DM白内障大鼠FINS及胰岛素抵抗系数(HOMA-IR)明显升高，与对照组相比差异显著(P<0.01)；而DHA组大鼠的FINS及HOMA-IR明显降低，且具有剂量依从性(P<0.01)，见表1。

表1　DM白内障大鼠FINS及药物干预作用

与对照组相比：1)P<0.01；与DM白内障组相比:2)P<0.05，3)P<0.01；下表、图同

2.2DM白内障大鼠MEK、ERK1/2、Ras和Raf mRNA表达分析DM白内障大鼠晶状体组织中MEK、ERK1/2、Ras和Raf mRNA表达明显升高，与对照组相比差异显著(P<0.01)，而DHA组大鼠上述蛋白的异常表达得到明显改善(P<0.01)，见表2。

2.3DM白内障大鼠Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Caspas 3、Caspase 9蛋白表达变化及DHA作用分析DM白内障大鼠晶状体组织中Ras、Raf、MEK、ERK1/2、Caspase 3、Caspase 9蛋白表达明显升高，且与对照组相比差异显著(P<0.01)，而DHA组大鼠上述蛋白的异常表达得到明显的改善(P<0.01)，见图1～图3。

表2　MEK、ERK1/2、Ras和Raf在不同组大鼠中mRNA表达的差异

图1　免疫印迹法分析Ras、Raf蛋白在不同组大鼠中表达的差异性及DHA的干预作用

图2　免疫印迹法分析MEK和ERK1/2蛋白在不同组大鼠中表达的差异性及DHA的干预作用

图3　免疫印迹法分析Caspase3及Caspase9蛋白在不同组大鼠中表达的差异性及DHA的干预作用

3讨论

CM及其并发症的发生率及死亡率逐年升高，严重威胁患者的生活质量和生存状态。本研究提示DHA能够有效缓解DM白内障大鼠症状，且其作用机制可能与抑制MEK信号转导通路激活相关。

MEK信号转导通路是细胞内最常见的信号通路之一，参与了DM多种并发症的发生及发展过程。在研究灯盏花素对人视网膜色素上皮细胞和DM大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)表达影响的研究中发现DM大鼠视网膜组织中VEGF及ERK通路蛋白的表达明显增强，且VEGF可能是由ERK信号通路调节的〔5〕。以往研究也发现DM大鼠白内障发病过程中表现为ERK信号通路的激活，且MEK抑制剂PD98059可以通过抑制该通路发挥作用〔6〕。郝祥俊等〔7〕也发现，DM大鼠肾脏损伤模型中ERK信号通路蛋白表达明显升高，而丝胶能够通过抑制ERK通路发挥治疗糖尿病肾病的作用。在对Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路与2型DM大鼠局灶性脑缺血早期作用的研究中也发现DM大鼠脑缺血早期过程中存在ERK通路的激活，且是该病理过程的主要机制〔8〕。林永廉等〔9〕也发现大蒜素能通过抑制ERK信号转导通路发挥对DM大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用。本研究也表明MEK通路的激活参与了

DM白内障的发病过程，且DHA可以通过抑制该通路发挥改善DM白内障并发症的作用。细胞凋亡是细胞的程序化死亡过程，DM视网膜病变组织中存在明显的细胞凋亡过程〔10〕。以往的研究也发现DM肾病组织〔11〕及DM心肌缺血再灌注大鼠模型〔12〕中都存在明显的细胞凋亡过程。本研究也表明细胞凋亡抑制也可能是DHA改善DM白内障并发症的作用机制之一。因此，DHA能够有效缓解DM白内障大鼠症状，且其作用机制可能与抑制MEK信号转导通路激活相关。

4参考文献

1邵毅,裴重刚,王乐,等.不同切口超声乳化术对糖尿病合并白内障患者角膜神经和泪液蛋白的影响研究〔J〕.中国现代医学杂志,2013;5(31):52-7.

2刘巨平,胡博杰,程朝晖,等.白内障超声乳化吸除术对糖尿病视网膜病变进展影响的Meta分析〔J〕.眼科,2013;4(6):378-82.

3尚军洁,董坤伦.肥胖2型糖尿病患者血浆中葡萄糖转运蛋白表达及其与细胞外信号调节激酶关系的临床观察〔J〕.中国糖尿病杂志,2015;10(4):323-6.

4黄海霞,黄海英.ERK1/2信号转导通路与糖尿病肾病的研究进展〔J〕.临床误诊误治,2013;7(5):106-8.

5王竞男,杨立群,邓宇斌.灯盏花素对人视网膜色素上皮细胞和糖尿病大鼠视网膜VEGF表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志,2015;9(5):900-5.

6肖涵,刘文斌,万丽.2型糖尿病大鼠白内障的ERK通路介导机制及其抑制剂PD98059的改善作用〔J〕.海南医学,2015;12(7):944-7.

7郝祥俊,于晓敏,宋成军,等.丝胶对糖尿病大鼠肾脏ERK信号通路的影响〔J〕.中国医科大学学报,2013;10(1):60-4.

8王文娟,武晓宁,贾玉洁,等.Ras/Raf/MEK/ERK信号传导通路在2型糖尿病大鼠局灶性脑缺血早期作用的研究〔J〕.重庆医学,2013;6(10):1122-4.

9林永廉,杨素芳.大蒜素对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡及MAPK信号传导通路的影响〔J〕.辽宁中医药大学学报,2011;7(3):56-8.

10王清,郭乔茜,李琴,等.臭氧治疗对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡和 VEGF、PEDF因子表达的影响〔J〕.眼科新进展,2014;6(3):45-7.

11陈骅,刘占全,张海松,等.发酵冬虫夏草菌粉对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响〔J〕.江苏医药,2014;8(2):153-5.

〔2015-10-12修回〕

(编辑李相军)

基金项目：湖北省教育厅中青年人才项目(No.Q20151901)

通讯作者：张新芳(1969-)，女，硕士，副主任医师，主要从事白内障、眼底病研究。

〔中图分类号〕R587.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)12-2864-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.017

1湖北民族学院附属民大医院眼科

第一作者：阳辉(1971-)，男，讲师，主要从事临床药理研究。