广西金秀野生茶遗传多样性及分子指纹图谱研究

陈莹玉，袁思思，吴春兰，赖幸菲，赵文芳，朱 燕，杨家干，黄亚辉，2



广西金秀野生茶遗传多样性及分子指纹图谱研究

陈莹玉1，袁思思1，吴春兰1，赖幸菲1，赵文芳1，朱 燕1，杨家干1，黄亚辉1，2

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州510642；2.华南园艺作物种质创新与利用广东省普通高校重点实验室，广东 广州510642）

摘 要：为了解广西金秀县野生茶资源的遗传进化轨迹以及品种特性，采用RAPD分子标记分析了该县4 地8个野生茶品种与云南、广东、湖南和福建等周边省份的15个茶树品种的亲缘关系，在相似系数0.76处可将23份材料分成四大类群。采用SSR分子标记，选取条带易于辨认、稳定性好、多态性较高的5对引物组合（顺序依次为SSR1110、SSR685、SSR478、SSR496、SSR228）构建了广西金秀县4地22份野生茶资源的分子指纹图谱，从而可简单有效地判别具体品种（系）。

关键词：野生茶；RAPD；SSR；亲缘关系；指纹图谱

野生茶树是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）茶组（Sect.Thea）植物野生种类的统称［1-3］。我国野生茶树种类繁多，类型丰富，分布广泛［4］。据统计，广西野生茶资源覆盖面积约200 hm2［5］，主要分布在具有良好自然生态条件的山区，年产量约50 t。金秀瑶族自治县位于广西壮族自治区中部偏东的大瑶山主体山脉上，根据黄亚辉等［6-7］近年实地调研发现，金秀县境内蕴藏着丰富的野生茶树资源，且辖区野生茶树资源为茶组茶种C. Sinensis （L.） O. Kuntze［8］。

我国野生茶树资源表型丰富，具有显著的基因遗传多样性［9］。目前，茶树种质资源遗传育种工作已取得了系列重要成果，其中DNA分子标记技术稳定性良好、可识别性高、迅速简便，明显优于其他传统形态标记技术，适用于品种鉴定［10-11］，已广泛应用于茶树育种工作中，使茶树种质资源得到了科学有效的评价和创新利用。RAPD、SCAR和ISSR等分子标记是茶树DNA基因水平遗传多样性研究的有效手段。Liu等［12］采用 ISSR分子标记技术对8个种群134份云南茶树资源进行亲缘关系分析，发现种群间遗传差异小。Fang等［13］利用ISSR 分子标记技术研究了185棵无性系茶树单株的基因多样性和亲缘关系，并通过聚类分析将其分为三大类。陈亮等［14］利用RAPD标记技术对15份茶树资源进行遗传多样性研究，从分子DNA水平证明了我国是茶树的原产地和发源地。Yang等［15］利用AFLP快速分离得到来自大理茶的15个微卫星标记，并对其进行鉴定。

本研究采用RAPD分子标记构建了广西金秀4地8个野生茶品种与其周边省份（包括云南、广东、湖南和福建）的15个茶树品种的亲缘关系图谱，并通过遗传距离以及形态特征综合分析了金秀野生茶资源的遗传多样性特征和原始特性，运用SSR分子标记技术构建22个品种（系）的分子指纹图谱，有利于这些茶树资源的登记保护、品种资源的创新利用，为野生茶资源的科学开发提供重要理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

RAPD试验材料取自广西金秀野生茶资源各单株以及华南农业大学园艺学院茶树资源圃茶树品种的新梢芽叶，共23份研究材料。其中，华南农业大学茶树资源圃茶树品种包括广东、福建、云南、湖南4个省份的代表性茶树品种各3～4个；广西金秀野生茶资源品种为随机选取的金秀白牛、六巷、共和、东温等地野生茶树资源品种各2个。SSR分子标记构建遗传图谱的材料取自广西金秀4地的22个单株。采摘各品种新梢芽叶，置于-80℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取及质量检测 参考陈亮等［16］的方法，并加以改进。

1.2.2 ISSR引物筛选及合成 从100条RAPD引物中优化筛选获取 17个对 5种茶树单株均可扩增出谱带且重复性好的引物。 具体ISSR引物序列参考文献［17-20］，由鼎国生物有限公司（广州）合成。

1.2.3 PCR扩增及结果检测 PCR扩增参照文献［21］的扩增程序和反应体系，通过凝胶电泳检测扩增效果，染色参照Charters等［22］的方法。

1.2.4 数据处理 使用人工读带的方法，对无带或难分辨的记作“0”，清晰且可重现性好的条带记作“1”，构建原始数据库。计算多态性信息量（polymorphism information content，PIC），公式如下：

PIC=1-ΣPi2［23］

式中，Pi代表第i条多态性条带和第i个等位位点的出现频率。当PIC＞0.5时，表明扩增位点具有高度多态性；当PIC在0.25～0.5时，为中度多态性；PIC＜0.25时，为低度多态性。

根据Jacard系数计算种质资源间相似系数，使用SAHN邻接法（Neighbor-joining method，NJ）对供试材料采用非加权平均法（UPGMA unweighted pair group method using arithmetic averages） 进行遗传相似性聚类，并绘制树状聚类图［23］。在Excel软件下比对指纹图谱代码，以最少的引物组合构建分子指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 RAPD标记技术研究广西金秀野生茶的亲缘关系

2.1.1 RAPD扩增产物及多态性分析 根据常用于茶树的100条RAPD引物，选出多态性好、条带清晰、重现性好的引物共17条，对供试的23份研究材料进行PCR扩增。结果（表1）表明，利用17条引物共扩增出172条条带，其中多态性条带136条，多态性达77.85%。每条引物扩增的带数在6～15条。其中，引物C11多态性最高、为93.33%，引物D13多态性最低、仅为62.50%。引物的多态性信息含量（PIC）平均为0.82，表现出扩增位点的高度多态性。

2.1.2 品种遗传相似系数及遗传多样性分析 由表2 可知，供试材料间的遗传相似系数GS变化范围为0.628～0.884，平均值为0.755。其中长叶白毫与佛香三号的GS最大、达到0.884，说明它们的遗传亲缘关系最近。相对而言，东温三号与黄金桂和政和大白的GS值最小，分别为0.63、0.63，说明它们存在较大的遗传距离。此外，东温三号与金秀其他地区的品种遗传距离均较远，GS介于0.64～0.70之间。六巷地区的茶树品种与金秀其他地区的遗传距离较远、GS介于0.66～0.76之间，而六巷二号和六巷九号之间的遗传距离也较远、GS为0.78，但六巷与共和、白牛的遗传距离相对东温较近。可见，广西金秀野生茶表现出丰富的遗传多样性。

表1 RAPD引物扩增产物多态性信息

表2 品种相似系数

2.1.3不同地域茶树品种间的亲缘关系 根据遗传相似系数矩阵，按UPGMA法对23个供试品种（系）进行聚类分析，构建了不同品种（系）间的聚类图（图1）。在相似系数为0.76处可以把23份材料分为4大类群：东温三号首先单独成为一个类群，六巷二号和六巷九号聚为一个类群；白牛、共和品种和东温二号聚为一个类群；云南、广东、福建、湖南的品种聚为一个类群。聚类分析结果表明，来源于同一地区的茶树品种往往形成单独的聚类群，遗传背景相似的品种也往往表现出较近的亲缘关系，广西金秀县的茶树品种表现出明显的遗传多样性和地域独特性。

图1 茶树品种亲缘关系聚类结果

2.2 SSR标记技术构建广西金秀野生茶的指纹图谱

2.2.1 SSR引物的筛选 对合成的15对SSR引物进行系统优化筛选，共获得9对具有清晰条带且多态性较好的引物（表3），将其作为备用引物用以构建分子指纹图谱。9对引物一共检测到36个等位位点，其中存在33个多态性位点。通过检测可知，平均每对引物的等位位点数为4个（多态性位点数3.67个），多态性位点最多有7个、最少只有1个。在所有PIC数值中，最小的是SSR1110、为0.35，最大的是SSR18、高达0.85，平均值为0.58，其中有8个不小于0.50。结果表明上述引物整体具有较高多态性。

2.2.2 茶树SSR带型识别及赋值 为了强化分子指纹图谱的准确性和一致性，简化茶树SSR带型的识别方法，缩短各品种（系）分子指纹图谱字符串长度，根据野生茶树SSR标记带型的具体特点，将每对SSR引物中位点的“0”、“1”编号转换为基因型代码，其转换规则为：从第1个品种（系）开始，第1个品种（系）基因型记为1，如果第2个与第1个带型相同记为1，有差异则记为2，依次类推。图2中的22个品种（系）的基因型编码依次为：1、2、1、3、1、4、1、5、4、0、4、4、4、5、6、1、7、1、8、5、4、7。

图2 引物685在22个单株中的扩增结果

2.2.3 野生茶树品种分子指纹图谱建立 使用上述9对引物对茶树单株DNA进行扩增，得到不同系列带型编码，以对应的引物顺序作为依据，串联各带型编码，即可形成一组数据代码，以此作为该茶树单株的分子指纹图谱编码。本研究通过比较选取的5对引物组合（SSR1110、SSR685、SSR478、SSR496、SSR228）构建了22个野生茶树单株的分子指纹图谱，使用5位数的数字编码代表每个茶树单株分子指纹图谱（表4）。例如，12号野生茶树单株的分子指纹图谱编码为24613，表示在该引物组合顺序下第1个引物的基因型编码为2、第2个为4、第3个为6，将其串联起来就可以代表该野生茶树品种的指纹图谱代码。

表3 SSR引物扩增产物多态性信息

表4 金秀22个单株的DNA分子指纹图谱号码

3 结论与讨论

本研究采用RAPD分子标记构建了广西金秀白牛、六巷、共和、东温4地8个野生茶品种与云南、广东、湖南和福建的15个茶树品种的亲缘关系图谱，并通过遗传距离和形态特征综合分析了金秀野生茶资源的遗传多样性和原始特性，结果表明广西金秀野生茶资源具有丰富的多样性，且具有原始特性，其中六巷、东温以及白牛野生茶资源性状较原始，共和最为进化。

本研究通过SSR分子标记构建了广西金秀县4地极具代表性的22份野生茶资源的DNA指纹图谱，使每个单株得到唯一的指纹身份证，从而可简单有效地判别各种单株。这将有助于茶树资源的登记保护、品种资源的创新利用，为金秀野生茶资源的科学开发提供重要理论基础。

根据RAPD分子标记研究结果分析，广西金秀野生茶资源类型丰富，有地域独特性，但无法从所研究的茶树资源与周边省份的茶树品种之间的亲缘关系判断其进化轨迹和进化程度，还需进一步研究探讨。在研究中还发现东温地区的资源独特性异常突出，其茶树资源地处原始森林中，单株零散分布，其资源特性和综合应用价值有待深入探究。

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（责任编辑 崔建勋）

中图分类号：S571.1；S502.4

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）03-0060-06

收稿日期：2015-09-11

基金项目：广东省科技计划项目（2013B020201 003，2015B020202007）；福建省“2011协同创新中心”中国乌龙茶产业协同创新中心（培育）专项（2013-51）；

作者简介：陈莹玉（1992-），女，在读硕士生，E-mail：609996608@qq.com

通讯作者：黄亚辉（1969-），男，博士，教授，E-mail：13501513191@163.com

Molecular fingerprint and diversity analysis of wild tea trees in Jinxiu county，Guangxi province

CHEN Ying-yu1，YUAN Si-si1，WU Chun-lan1，LAI Xin-fei1，ZHAO Wen-fang1，ZHU Yan1，YANG Jia-gan1，HUANG Ya-hui1，2
（1. College of Horticulture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2. Key Laboratory of Innovation and Utilization for Germplasm Researches in Horticultural Crops in Southern China of Guangdong Higher Education Institutes，Guangzhou 510642，China）

Abstract：In order to track the genetic evolution path and understand the characteristics of varieties of wild tea germplasms in Jinxiu county，Guangxi province，we adopted the RAPD molecular markers to analyze the genetic relationship between eight kinds of wild tea plants from four places in Jinxiu and 15 varieties of tea plants from four provinces，including Yunnan，Guangdong，Hunan and Fujian around Guangxi. The results showed that all the materials could be divided into four groups in the similarity coefficient of 0.76. We also used the SSR molecular marker to construct the genetic fingerprint of 22 varieties of wild tea germplasms in Jinxiu county of Guangxi province. In SSR molecular marker，5 primer pairs（SSR1110，SSR685，SSR478 SSR496 SSR228）bands with easily identification，good stability and high polymorphism，were choosen to construct the molecular linkage map of 22 plants. Each plant had its own unique fingerprint identification card，which could effectively distinguish one from another.

Key words：wild tea plant；RAPD；SSR；genetic relationship；molecular fingerprint