三叶青叶指纹图谱研究及8种酚类成分含量测定

范世明+徐惠龙+谢心月+蔡碧雅+邹福贤+许文+谢志森+黄心平

[摘要]采用超高效液相色谱建立三叶青叶指纹图谱，并同时测定8种酚类成分（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷）的含量，为三叶青叶质量评价提供依据。采用UHPLC法，Welch UHPLC Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸（含5%甲醇）水梯度洗脱，流速0.4 mL·min^-1，柱温30 ℃，采用国家药典委员会“相似度评价软件2004AB”处理分析，建立41批不同产地三叶青叶的指纹图谱，共标定15个共有峰并对不同产地进行聚类分析，然后选择其中8个主要的酚类成分作为定量指标，建立UHPLC同时测定8种主要酚类成分含量的方法，经方法学验证该研究建立的三叶青叶指纹图谱和8种酚类成分含量测定方法简便有效、灵敏、准确，可为综合评价三叶青叶的质量提供参考。

[关键词]三叶青叶； UHPLC； 指纹图谱； 含量测定

[Abstract]A novel method combining ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） fingerprint and simultaneous quantitative analysis of eight phenolic components was developed and validated for quality evaluation ofTetrastigma hemsleyanum leaves. For fingerprint analysis， 15 peaks were selected as the common peaks to evaluate the similarities among 41 batches ofT. hemsleyanum leaves collected from different regions. Additionally， simultaneous quantification of eight markers， including neochlorogenic acid， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， isoorientin， orientin， vitexin-2-O-rhamnoside，vitexin and isovitexin， was performed and the obtained data demonstrated that our method has achieved desired linearity， precision and accuracy. Clustering statistical analysis was further application inT. hemsleyanum leaves from different regions. The results indicated that new approach conbine ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） fingerprint and simultaneous quantitative analysis of eight phenolic components was applicable in quality control ofT. hemsleyanum leaves.

[Key words]Tetrastigma hemsleyanum leaves； UHPLC； fingerprint analysis； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162115

三葉青是我国特有的珍稀药用植物，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，以块根或者全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效^[1]，并广泛用于多种国药准字中成药，如排石利胆胶囊、华佗风痛宝、结石康胶囊等。前期课题组已经针对三叶青的块根进行了质量评价^[2-4]，但由于三叶青对生长环境的要求较为苛刻，在自然条件下生长缓慢，加上近年来针对三叶青块根人为无节制的采挖，野生的三叶青已经成为濒危药用植物^[5]，目前多数三叶青药材的使用多为块根部位，对三叶青叶资源的开发利用的报道较少，而现代药理研究表明三叶青叶也具有抗炎、镇痛、解热、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫^[6-7]等作用，同时也是结石康胶囊等中成药的直接原料，因此为了加大三叶青资源的应用，本文采用UHPLC建立三叶青叶指纹图谱，并同时测定8种主要酚类成分（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷）的含量，为三叶青叶质量评价提供依据。

1 材料

安捷伦LC1290超高效液相色谱仪（安捷伦公司）；CPA225D型1/10万分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-500E台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FY135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（德国MERCK公司），Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司），其余试剂均为分析纯。

对照品新绿原酸（批号SH906332）、隐绿原酸（批号SH905997）、1-咖啡酰奎宁酸（批号SH1241878）和咖啡酸（批号SH331395）购自北京赛百草科技有限公司，异荭草苷、荭草苷、荭草素鼠李糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷、绿原酸由本实验室分离制备^[8-9]，纯度经HPLC-DAD（面积归一法）检测纯度均大于98.0%。

三叶青叶41批样品分别采自不同产地，经福建中医药大学药用植物实验室范世明高级实验师及生药教研室黄泽豪副教授鉴定，为葡萄科植物三叶青T. hemsleyanum的干燥叶，样本存放于福建中医药大学药学院药用植物标本室，样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱研究色谱条件

采用Welch UHPLC Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流动相为乙腈（A）-水（含0.1%甲酸，5%甲醇）（B），流速0.4 mL·min^-1，柱温30 ℃，进样量5 μL，梯度洗脱（0～2 min， 2% A； 2～4 min， 2%～10% A； 4～7 min， 10% A； 7～15 min， 10%～12% A； 15～20 min， 12% A； 20～30 min， 12%～18% A； 30～50 min， 18%～20% A），检测波长330 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷对照品适量，精密称定，加入甲醇分别制备质量浓度为0.556， 0.580， 0.592， 0.552， 0.562， 0.620， 0.566， 0.570 g·L^-1的单一对照品储备液。其他质量浓度的对照品溶液由80%甲醇稀释储备液得到。

2.2.2 供试品溶液制备 将三叶青干燥叶粉碎过60目筛得三叶青叶粉末。取三叶青叶粉末0.1 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min（250 W， 50 kHz），放冷，再称定质量，用80%甲醇补足失重，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱研究方法学考察

2.3.1 精密度試验 精密吸取同一份三叶青叶供试品5 μL连续进样6次记录色谱图，以牡荆苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD小于0.041%、相对峰面积RSD小于2.1%，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”进行评价，相似度为0.99，表明仪器精密度好。

2.3.2 重复性试验 取同一批三叶青叶子粉末6份，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 μL，记录色谱图，以牡荆苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD小于0.035%、相对峰面积RSD小于2.1%，相似度为0.99，表明该方法重复性好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液5 μL，分别在0， 2， 4， 8， 12， 24 h进样，记录色谱图，以牡荆苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间RSD小于0.037%，相对峰面积RSD小于1.8%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.4 三叶青叶的指纹图谱建立

将41批三叶青叶制备成供试品溶液进样5 μL，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”进行数据处理， 设定S1为参照图谱， 将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配， 生成三叶青叶指纹图谱色谱叠加图，见图1。

2.4.1 共有峰的标定 根据41批三叶青叶的指纹图谱检测结果，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”，在对照图谱上共标定15个共有峰，色谱图中保留时间（tR）为38.97 min处的13号色谱峰（牡荆苷）响应较高，分离良好，保留时间合适，故此选此峰为参照峰，同时采用课题组分离的三叶青化学成分进行色谱共有峰指认，鉴定其中12个共有峰，见图1。

2.4.2 三叶青叶指纹图谱相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”，对41批不同产地三叶青药材的指纹图谱检测数据进行数据处理，分析了41批三叶青药材的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，见表2。

2.4.3 聚类分析 采用DPS 16.0将41批三叶青的15个共有峰峰面积作为原始数据进行系统的聚类分析，见图2。可知在阈值大于4.8时，三叶青叶资源可以分为两大类；2.5～3.5时可以分为4大类[第1类（5个）：S13，S14，S6，S4，S3；第2类（2个）：S2，S5；第3类（19个）：S26，S23，S24，S19，S38，S32，S18，S41，S40，S37，S17，S33，S35，S25，S28，S22，S16，S29，S15；第4类（15个）：S8，S12，S31，S11，S9，S36，S7，S30，S21，S34，S20，S39，S10，S27，S1]，同时对15个共有峰面积进行聚类主成分分析，发现新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷为指纹图谱共有模式的最主要成分，因此选择这8个指标进行含量测定研究。

2.5 三叶青中8种酚类成分含量测定

2.5.1 色谱条件 采用Welch UHPLC Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（含5%甲醇）（B），流速0.4 mL·min^-1，柱温30 ℃，进样量5 μL，梯度洗脱（0～2 min， 1% A； 2～4 min， 1%～9% A； 4～7 min， 9%～9% A； 7～15 min， 9%～12%A； 15～20 min， 12% A； 20～30 min， 12～18% A； 30～50 min， 18%～20% A）， 检测波长330 nm。

2.5.2 供试品和对照品溶液制备 同2.2项下方法制备供试品和对照品溶液。

2.5.3 系统适用性试验 按2.5.1项下色谱条件进行分析，8个成分理论塔板数均大于5 000，分离度大于1.5，对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图3。

2.5.4 检测线与定量限 在选定的色谱条件下，通过稀释不同浓度的标准品得到各个化合物的定量限（S/N为10）和检测限（S/N为3），见表3。

2.5.5 线性和范围考察 取各对照品储备液，用80%甲醇分别稀释10，12.5，16.6，5，50，200，250，500，1 000，2 500，5 000倍的8种系列对照品混合溶液。精密吸取5 μL进样并测定峰面积，以峰面积（Y）对分析物浓度（X）作线性回归曲线，得到回归方程和相关系数，结果见表3。

2.5.6 精密度试验 精密吸取同一份对照品混合溶液5 μL，1日内连续进样6次，连续进样3 d，记录8种酚类成分的峰面积，其峰面积日内精密度和日间精密度的RSD范围均在1.4%～2.1%，表明精密度良好。

2.5.7 稳定性试验 制备一份供试品，取该供试品溶液分别于0， 2， 6， 10， 12， 24 h进样分析，记录8种酚类成分的峰面积，其峰面积的RSD范围均在1.1%～1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.8 重复性试验 精密称取同一批三叶青样品6份，制备成供试品溶液进样测定峰面积，计算8种酚类成分的含量，其含量RSD范围均在1.4%～3.0%，表明方法重复性良好。

2.5.9 回收率试验 精密称取已知含量的样品0.05 g，平行6份，分别精密加入一定量（近似1∶1）的各个对照品液，按照2.2.2项下制备供试品溶液，进样测定峰面积，计算含量，得到平均回收率为96.50%～103.2%，RSD为2.7%～3.7%。

2.5.10 样品含量测定 分别精密称取不同批次的三叶青叶样品粉末0.1 g，制备成供试品溶液，进样测定峰面积，根据标准曲线计算其含量，结果见表4。

3 讨论

3.1 三叶青叶的提取

在样品前处理上，考察了不同的提取方法（回流、超声、索氏提取）、提取溶剂（不同浓度甲醇、乙腈）、溶剂倍量、提取次数、提取时间对实验的影响。结果表明超声提取和回流提取效果較佳，且两者无明显差异，故样品制备最终采用超声提取，即50倍量甲醇，超声30 min，提取1次。

3.2 色谱条件的选择

在色谱柱选择上，通过比较不同厂家不同粒径色谱柱对三叶青叶中8种酚类成分的分离效果，最终选择Welch UHPLC Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）。该色谱柱其颗粒填料小于普通HPLC柱，其柱效显著高于普通5，3 μm粒径色谱柱，色谱峰更窄从而灵敏度更高，分析时间缩短，流速也减小为0.4 mL·min^-1，节约流动相。对于流动相系统的选择，先后比较了4 种流动相系统：乙腈-（含5%甲醇+0.1%甲酸）水，乙腈-0.1% 甲酸水，甲醇-0.1%甲酸水，甲醇-0.5%醋酸水，结果表明，乙腈-（含5%甲醇+0.1%甲酸）水三元溶剂系统能使指纹图谱和含量测定系统分离度更好。经过DAD光谱扫描，8种酚类成分在检测波长330 nm下均有最大吸收波长，故选择330 nm为检测波长。

3.3 三叶青叶与块根指纹图谱比较

本次实验根据41批三叶青叶的指纹图谱检测结果，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”，以牡荆苷作为参照峰，共标定15个共有峰，经过标品比对鉴定其中12个共有峰，并且经过相似度评价41批样品的相似度均达到0.9以上，在阈值设定2.5～3.5时可以分为四大类。而查阅文献，目前报道三叶青指纹图谱研究的报道较少：程林等^[10]采用HPLC对三叶青块根进行指纹图谱研究，以β-谷甾醇为参照峰，共标定了7个共有峰，并且对所采集的10个批次块根样品进行相似度分析，结果显示块根相似度为0.823～0.928，认为可能由于产地、气候、土壤等因素导致三叶青块根化学成分存在一定的差异；张煜炯等^[11]对17批次的三叶青块根氯仿部位进行HPLC指纹图谱研究，共标定15个共有峰，其中3个峰被确认为槲皮素、山柰酚-3-O-新橙皮糖苷和β-谷甾醇，经过聚类分析将17批样品分为5类，17批样品的相似度达到0.816～0.985，提示三叶青块根的指纹图谱的相似度相对低于叶子，并且从文献指纹图谱来看，三叶青叶子和块根整体共有模式存在较大的差异。另一方面，从化学成分来看，课题组前期对三叶青块根进行LC-Q-TOF-MS分析，共鉴定了块根中24种成分^[3]，主要为有机酸如绿原酸和氧苷黄酮类成分，如山柰酚-3-O-芸香糖苷；而本研究发现三叶青叶中除了绿原酸等有机酸成分外，主要黄酮类成分为碳苷类黄酮，如牡荆苷等，提示三叶青块根和叶指纹图谱的差异性可能是由于其化学成分种类和含量上存在差异性所致。

3.4 样品测定结果

对于41批不同产地三叶青叶含量测定及指纹图谱研究，结果表明，不同产地三叶青叶中含有的化学成分种类差异不大，但8种酚类成分含量具有较大差异：从8个成分的含量均值来看，含量最高的为绿原酸，其质理分数范围在0.413～17.077 mg·g^-1，并且以产地福建闽侯（S2）、福建福安（S13，S14）含量较高；其次是异荭草苷和牡荆苷，其质量分数范围分别为0.420～5.716，0.353～7.338 mg·g^-1，其中，福建闽侯（S2）、福建福州（S6）、福建福安（S14）产地的异荭草苷含量较高，福建闽侯（S2、S5）、浙江丽水（S4）产地的牡荆苷含量较高；而隐绿原酸的含量相对最少，质量分数范围0.047～1.424 mg·g^-1，仅仅产地福建闽侯（S2，S5）较高于其他产地；从8种酚类成分总和来看，福建闽侯（S2，S5）、福建福安（S14）种植地的三叶青样品的总酚含量最高，达到2.3%以上，提示该产地三叶青叶子适合于三叶青总酚物的进一步开发利用。不同产地三叶青含量上存在较大的差异外因上可能与不同地理环境（产地、气候、土壤、温度）、生长年限等有关，内因上可能是由于不同产地三叶青叶中酚类成分的合成代谢酶的表达量存在差异，因此，课题组下一步拟从转录组角度分析不同产地三叶青中Unigene的差异性以揭示不同产地三叶青块根和叶有效成分含量或者种类差异的原因。

4 结论

本实验建立了UHPLC同时测定三叶青中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异荭草苷、荭草苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆苷、异牡荆苷8种酚类成分含量及指纹图谱的方法，该方法简便准确，重复性好，可以为三叶青药材质量控制提供新的方法与参考依据。

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[责任编辑 丁广治]