萹蓄配方颗粒的HPLC指纹图谱研究

高颖+张云天

摘 要：目的是采用HPLC法建立萹蓄配方颗粒的指纹图谱分析方法。采用HPLC法，以Megres5-C18（Hanbon，250 mm× 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱；检测波长为0～15 min，260 nm，15～65 min，350 nm；流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。结果表明，构建的指纹图谱共有7个共有峰，各批次萹蓄配方颗粒样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在0.95以上，可用于萹蓄配方颗粒的定性鉴别。结论是，建立的指纹图谱重现性好，可为提高萹蓄配方颗粒的质量控制提供有益的信息。

关键词：萹蓄配方颗粒；HPLC法；指纹图谱；特征峰

中图分类号：R284.1 文献标识码：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2015.15.013

文章编号：2095-6835（2015）15-0013-02

萹蓄为蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，具有利尿通淋、杀虫止痒的功效，临床多用于治疗泌尿系统感染、非胰岛素依赖性糖尿病、细菌性痢疾、结石和肾炎等疾病。据文献报道，黄酮类成分是萹蓄抗菌消炎的主要活性成分。萹蓄配方颗粒是由萹蓄饮片加工制成的，具有免煎易服、易储存和使用方便等优点。传统的质量控制指标单一，难以反映萹蓄配方颗粒的真实质量。鉴于此，本文采用HPLC法建立萹蓄配方颗粒的指纹图谱，实现从整体上控制萹蓄配方颗粒质量的目的，为更有效地控制萹蓄配方颗粒质量提供科学的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent-G1311C四元泵、Agilent-G1329B进样器、Agilent-G1315D DAD检测器、CHEMSTATION B.04.02化学工作站和超声波清洗器（无锡超声电子设备公司）。

1.1.2 试剂和药材

萹蓄配方颗粒是由江阴天江药业有限公司提供的，没食子酸对照品（编号111083-201204）购于中国药品生物检定所，杨梅苷对照品（编号111860-201101）购于中国食品药品检定所，槲皮苷对照品（编号111538-200504）购于中国药品生物检定所，槲皮素对照品（编号100081-200907）购于中国食品药品检定所，山奈素对照品（编号110861-200808）购于中国食品药品检定所。乙腈为色谱纯（上海振兴化工一厂），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含57.6 μg的溶液，即得；精密称取杨梅苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含58.7 μg的溶液，即得；精密称取槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含123.0 μg的溶液，即得；精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含65.0 μg的溶液，即得；精密称取山奈素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含22.0 μg的溶液，即得。

1.2.2 供试品溶液的制备

取萹蓄配方颗粒0.5 g置具塞锥形瓶中，精密加入质量分数为60%的乙醇25 mL，称定质量，超声处理（功率200 W，

频率40 kHz）30 min，放冷至室温，再称定质量，用质量分数为60%的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，离心，取续滤液，即得。

1.2.3 色谱条件

Megres5-C18（Hanbon，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相以乙腈为流动相A，以质量分数为0.1%的磷酸水溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱。

表1 萹蓄配方颗粒特征图谱梯度洗脱表

检测波长为0～15 min，260 nm，15～65 min，350 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL。在此色谱条件下，对照品和样品中各色谱峰均获得了较好的分离。

2 结果

2.1 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样5次，以3号峰杨梅苷为参照峰，考察7个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%.结果表明，仪器的精密度良好。

2.2 重复性试验

取同一批萹蓄配方颗粒（批号：1207019），按1.2.3项下制备方法平行操作，制备5份供试品溶液，分别进样10 μL分析。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间及其相对峰面积的RSD均小于3%.这表明该方法的重复性良好。

2.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，以3号峰杨梅苷为参照峰，考察7个共有峰指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%. 结果表明，供试品溶液放置24 h，其稳定性良好。

2.4 建立指纹图谱

2.4.1 确定特征峰

采用相对保留时间标定共有峰，以杨梅苷为参照峰（S），将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照峰的保留时间相比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算10批样品特征图

谱中各色谱峰的相对保留时间和峰面积，筛选出7个共有峰，如图1所示，其特征峰的相对保留时间为0.29（峰1）、0.70（峰2）、1.00（峰3）、1.17（峰4）、1.19（峰5）、1.45（峰6）和1.54（峰7）。峰1为没食子酸，峰3为杨梅苷，将其作为S峰，峰5为槲皮苷，峰6为槲皮素，峰7为山奈素。

图1 10批萹蓄配方颗粒的共有特征峰

2.4.2 特征图谱相似度评价

将所得到的色谱数据导入采用药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”中，设定参照图谱，采用多点校正将色谱峰自动匹配，然后生成对照图谱进行相似度评价。结果表明，10批样品的相似度均在0.95以上，说明这10批萹蓄配方颗粒的差别很小，质量比较稳定。

3 分析结果讨论

该实验构建了萹蓄配方颗粒HPLC指纹图谱，以杨梅苷为参照峰确定了7个共有峰，各峰的保留时间匹配比较好，其相对保留时间RSD均小于3%.利用相似度软件计统计江阴天江药业10批萹蓄配方颗粒样品，对照图谱和各批样品之间的相似度比较好，不同批次萹蓄配方颗粒指纹图谱的色谱峰整体基本一致，具有专属性，为有效控制萹蓄配方颗粒质量提供了科学的方法。

参考文献

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〔编辑：白洁〕