氧化苦参碱体外抑制胰腺星状细胞激活和p38-MAPK mRNA表达

许威　陈凯　向晓辉　夏时海



·论著·

氧化苦参碱体外抑制胰腺星状细胞激活和p38-MAPK mRNA表达

许威陈凯向晓辉夏时海

300162天津，武警后勤学院附属医院肝胆胰脾中心(消化二科)

【摘要】目的验证氧化苦参碱(OM)在体外对胰腺星状细胞(PSC)激活的抑制作用，探讨其作用机制。方法观察经不同浓度OM干预后大鼠PSC细胞株LTC-14在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导激活后的增殖能力，应用ELISA法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)水平，用实时定量PCR法检测细胞丝裂原激活蛋白激酶p38(p38-MAPK) mRNA表达量。结果对照组及0.1、0.5、1、2、5 g/L OM干预30 min后再加8 μg/L TGF-β1诱导组(OM组)细胞在培养12 h后的细胞增殖分别为1.51±0.08、1.50±0.07、1.15±0.04、1.15±0.04、1.08±0.06、1.08±0.10，0.5 g/L以上的OM组低于对照组，差异有统计学意义(P值均为0.000)。对照组、TGF-β1组及0.5、1 g/L OM组培养12 h后LTC-14细胞SOD的水平分别为0.087±0.005、0.073±0.004、0.085±0.010、0.086±0.007，各组间差异无统计学意义；p38-MAPK mRNA表达量分别为1.000±0.000、1.979±0.505、0.606±0.111、0.303±0.159，TGF-β1组显著高于对照组(P=0.002)，两个OM组均低于TGF-β1组(P值均为0.000)，但两个OM组间差异无统计学意义(P=0.208)。结论OM体外能够抑制PSC的激活，其作用机制可能是通过抑制p38-MAPK mRNA表达实现的。

【关键词】氧化苦参碱；胰腺星状细胞；激活；氧化应激；p38-MAPK

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81173393)；Tianjin Science and Technology Commission(12JCZDJC25500, 15JCQNJC45600)；Innovative Team of Logistics University of the Chinese People′s Armed Police Forces(WHTD201310)；Seed Fund of Affiliated Hospital of Logistics University of the Chinese People′s Armed Police Forces(FYM201114);Doctor′s Initial Fund of Logistics University of the Chinese People′s Armed Police Forces(WHB201515)

慢性胰腺炎(CP)以胰腺纤维化为主要病理特征，胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell，PSC)的激活是胰腺纤维化的关键过程[1]。有研究证实，氧化苦参碱(oxymatrine，OM)对肝脏等器官的纤维化有明显的治疗作用并已用于临床[2]，其作用机制可能是抑制肝星状细胞的增殖。本课题组前期研究证实，OM能减轻CP大鼠的胰腺纤维化[3-4]，但具体机制不明。本研究通过体外细胞实验观察OM对PSC激活的影响，探讨氧化应激和丝裂原激活蛋白激酶p38(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)是否参与该过程。

材料与方法

一、材料及试剂

永生化的大鼠胰腺星状细胞株LTC-14由德国Rostock大学医院Jaster教授惠赠[5]。OM、MTT购于 Sigma公司。IMDM培养基购于Hyclone公司。胎牛血清购于Gibco公司。PCR逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒购自北京全式金公司。超氧化物歧化酶(SOD) ELISA试剂盒购于德国IBL公司。

二、MTT法检测PSC增殖状况

LTC-14细胞复苏后常规培养、传代。取对数生长期细胞，以每孔103个细胞接种于96孔板，分别加入4、8、12、16、20 μg/L的TGF-β1，以不加TGF-β1的细胞为对照组，每组设3个复孔。分别培养6、12、24 h，加入MTT 5 mg/ml，继续培养4 h后终止培养，甩尽培养液，加入150 ml DMSO，震荡10 min，上酶标仪测每孔在570 nm波长处的吸光度值(A570值)，筛选有效诱导PSC增殖的最小TGF-β1干预浓度及干预时长。

同样取对数生长期细胞接种96孔板，分别加入0.1、0.5、1、2、5 g/L OM，以不加OM的细胞作为对照组，每孔设3个复孔。培养30 min后加入上述实验筛选出的最小TGF-β1干预浓度培养6、12、24 h，加MTT继续培养4 h，测各孔A570值，筛选抑制PSC增殖的最佳OM干预浓度及干预时长。

三、ELISA法检测细胞SOD水平

按试剂盒说明书要求稀释标准品后加入96孔板，取对数生长期细胞接种96孔板，根据上述实验获得的最佳OM干预浓度及干预时长处理30 min后用最小浓度TGF-β1诱导细胞(OM组)，同时设单加TGF-β1的TGF-β1组及不加任何处理的对照组，每组设3个复孔。封板膜后37℃温育30 min，弃培养液，用试剂盒里包含的洗涤液重复洗涤5次，每孔加入酶标试剂50 μl，37℃温育30 min，洗涤5次，每孔先后加入显色剂A和B各50 μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10 min，加终止液50 μl终止反应，上酶标仪测各孔A450值。

四、实时PCR法检测细胞p38-MAPK mRNA表达

查询相关文献和GenBank，用primer5.0软件设计p38-MAPK引物，正义序列5′-CAGGAGCTGAACAAGACCGT-3′，反义序列5′-CCTGTAGGTCCTTTTGGCGT-3′，产物200 bp；内参β-actin正义序列5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′，反义序列5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′，产物200 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。采用Trazol抽提各组细胞总RNA，定量后逆转录为cDNA，按试剂盒说明书步骤应用 SYBR染料法在ABI7500实时PCR仪上扩增，绘制溶解和扩增曲线。通过仪器自带软件获取Ct值，按公式2-ΔΔCt计算mRNA表达量。

五、统计学处理

结果

一、PSC增殖的变化

诱导PSC增殖的最小TGF-β1浓度为8 μg/L，诱导时间为12 h(表1)。

在OM干预30 min后以8 μg/L TGF-β1诱导LTC-14细胞。当诱导时间为6 h时各组细胞增殖水平差异无统计学意义(P=0.739)；诱导时间为12、24 h、且OM浓度在0.5 g/L以上时细胞的增殖均低于对照组和0.1 g/L OM组(P值分别为0.000、0.001)，而0.5 g/L以上的各OM组之间差异无统计学意义(表2)。

表1　不同浓度TGF-β1诱导后PSC的A570值

注：与对照组比较，aP<0.01；与4 g/L组比较，bP<0.01

表2　不同浓度OM干预后PSC的A450值

注：与对照组比较，aP<0.01；与0.1 g/L组比较，bP<0.01

二、细胞SOD水平及变化

对照组、TGF-β1组及0.5、1 g/L OM组干预12 h后LTC-14细胞SOD的A450值分别为0.087±0.005、0.073±0.004、0.085±0.010、0.086±0.007，各组间差异无统计学意义(P=0.095)。

三、细胞p38-MAPK mRNA表达的变化

对照组、TGF-β1组及0.5、1 g/L OM组干预12 h后LTC-14细胞p38-MAPK mRNA表达量分别为1.000±0.000、1.979±0.505、0.606±0.111、0.303±0.159。TGF-β1组显著高于对照组(P=0.002)，两个OM干预组均显著低于TGF-β1组(P=0.000)，但两个OM干预组间差异无统计学意义(P=0.208)。

讨论

苦参系药用豆科槐属植物苦参的干燥根，性寒味苦，始载于我国最早的药学文献《神农本草经》。随着分离提取技术的进步,发现在苦参、苦豆子、广豆根中存在同一类以OM为代表的生物碱。OM化学分子式为C15H24N2O2，分子质量为282，是苦参型生物碱的主要活性成分，有多方面的药理作用，如抗菌、抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗过敏、免疫及生物反应调节作用等[6]。近年大量的实验和临床研究结果表明OM具有明显的抗器官纤维化作用，如抗肝纤维化、抗皮肤纤维化和抗肾间质纤维化等，其中以抗肝纤维化研究较为深入。本课题组前期研究也证实OM具有抗胰腺纤维化的作用[3-4]，结合近年研究报道的PSC激活在胰腺纤维化中的重要角色，故推测OM很可能是通过抑制PSC的激活以实现抗胰腺纤维化的作用。PSC激活的重要标志就是增殖能力明显增强，本研究结果显示，0.5 g/L以上的OM干预PSC 12 h以上能够显著抑制TGF-β1所激活的PSC的增殖，表明OM体外能够抑制PSC激活。

氧化应激是PSC激活的重要机制。在慢性酒精性胰腺炎纤维化区可见脂质过氧化产物，并观察到激活的PSC。体外实验证实乙醇能够激活PSC，其机制可能与细胞内氧化应激有关[7]。体内实验证实，应用乙醇后胰腺细胞内出现氧化应激是胰腺损伤的早期反应。OM有可能通过降低氧化应激水平来抑制PSC激活。本研究结果显示，OM 干预后LTC-14细胞SOD水平未发生显著变化，说明OM抑制PSC激活的作用不是通过抑制氧化应激反应实现的。

近年对PSC激活的分子机制进行了一些研究。MAPKs是一类细胞内广泛分布的具有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶，有4种MAPKs，其中ERK1/ERK2、JNK1/JNK2、p38-MAPK最具代表性。McCarroll等[8]研究发现，乙醇和乙醛能够增加PSC提取液中ERK1/2、JNK、p38-MAPK的表达，用这3种激酶的特异性抑制剂干预后只有p38-MAPK的特异性抑制剂能抑制PSC的α-SMA表达，提示p38-MAPK途径介导了乙醇和乙醛诱导的PSC激活。Masamune等[9]研究也有类似结果。本研究结果显示，TGF-β1刺激PSC后p38-MAPK mRNA水平较对照组增高，OM干预则降低p38-MAPK mRNA水平，提示OM可能通过抑制p38-MAPK的转录来抑制PSC的激活。

(志谢感谢香港浸会大学卞兆祥教授和天津中医药大学商洪才教授对本工作的帮助！)

参考文献

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[2]Mao YM, Zeng MD, Lu LG, et al. Capsule oxymatrine in treatment of hepatic fibrosis due to chronic viral hepatitis: a randomized, double blind, placebo-controlled, multicenter clinical study[J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(22): 3269-3273.DOI: 10.3748/wjg.v10.i22.3269.

[3]苏丽婷, 夏时海, 郑永青. 转化生长因子β1Ⅱ型受体在大鼠慢性胰腺炎中的表达及氧化苦参碱对其的影响[J]. 世界华人消化杂志, 2011,19(2): 121-125.

[4]王昱良, 郑永青, 夏时海, 等. 氧化苦参碱对慢性胰腺炎胰腺组织中Ⅰ型胶原及α-SMA的影响[J]. 世界华人消化杂志, 2010, 18(13):1331-1336.DOI: 10.3969/j.issn.1009-3079.2010.13.006.

[5]Tsang SW, Zhang H, Lin C, et al. Rhein, a natural anthraquinone derivative, attenuates the activation of pancreatic stellate cells and ameliorates pancreatic fibrosis in mice with experimental chronic pancreatitis[J]. PloS One, 2013, 8(12): e82201.DOI：10.1371/journal.pone.0082201.

[6]李屹, 张丽楠, 杨磊. 苦参碱药理作用研究进展[J]. 实用中医药杂志, 2012, 28(5): 423-424. DOI: 10.3969/j.issn.1004-2814.2012.05.061.DOI:10.3969/j.issn.1004-2814.2012.05.061.

[7]Apte MV, Phillips PA, Fahmy RG, et al. Does alcohol directly stimulate pancreatic fibrogenesis? Studies with rat pancreatic stellate cells[J]. Gastroenterology, 2000, 118(4): 780-794.DOI:10.1016/S0016-5085(00)70148-X.

[8]McCarroll JA, Phillips PA, Park S, et al. Pancreatic stellate cell activation by ethanol and acetaldehyde: is it mediated by the mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]? Pancreas, 2003, 27(2): 150-160.DOI:10.1097/00006676-200308000-00008.

[9]Masamune A, Kikuta K, Satoh M, et al. Alcohol activates activator protein-1 and mitogen-activated protein kinases in rat pancreatic stellate cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002, 302(1): 36-42.DOI:10.1124/jpet.302.1.36.

(本文编辑：吕芳萍)

Oxymatrine suppressed the activation of pancreatic stellate cells and p38-MAPK mRNA expression in vitro

XuWei,ChenKai,XiangXiaohui,XiaShihai.

SecondDepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityoftheChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China

【Abstract】ObjectiveTo clarify whether oxymatrine(OM) could suppress the activation of pancreatic stellate cells (PSC) and explore the potential molecular mechanism. MethodsThe proliferation of PSC line LTC 14 being activated by TGF-β1 with OM treatment at different concentrations (OM group) was measured. SOD level was determined by ELISA and p38-MAPK mRNA was determined by real-time PCR. ResultsThe proliferation of PSC in the control group, 0.1, 0.5, 1, 2, 5 g/L OM group was (1.51±0.08), (1.50±0.07), (1.15±0.04), (1.15±0.04), (1.08±0.06), and (1.08±0.10), respectively. The level of the control group was lower than the groups where the concentration of OM reached or exceeded 0.5mg/ml (all P=0.000). SOD level of LTC 14 cells in the control group, TGF-β1 group, 0.5 and 1 g/L OM group was (0.087±0.005), (0.073± 0.004), (0.085±0.010), and (0.086±0.007), respectively. No statistically significant difference existed among the groups (P=0.095). The p38-MAPK mRNA expression of PSC in the control group, TGF-β1 group, 0.5, and 1 g/L OM group was (1.000±0.000), (1.979±0.505), (0.606±0.111), and (0.303±0.159), respectively. The p38-MAPK mRNA level of TGF-β1 group was higher than that of the control group (P=0.002), and that of 0.5 mg/ml OM group and 1 mg/ml OM group was lower that of TGF-β1 group (P=0.000), while no statistical difference was found between 0.5 mg/ml OM group and 1 mg/ml OM group. ConclusionsOM could suppress the activation of PSC in vitro and the suppression of p38-MAPK mRNA expression may be involved.

【Key words】Oxymatrine;Pancreatic stellate cell;Activation;p38-MAPK

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.010

通信作者：夏时海，Email：xshhcx@sina.com

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81173393)；天津市自然科学基金项目(12JCZDJC25500、15JCQNJC45600)；武警后勤学院创新团队基金项目(WHTD201310)；武警后勤学院附属医院科研种子基金面上项目(FYM201114)；武警后勤学院博士启动金项目(WHB201515)

Corresponding author:Xia Shihai, Email: xshhcx@sina.com

(收稿日期：2015-08-11)