归脾汤对支气管哮喘的抑制作用研究

河北省辛集市献血办公室

张　峰　穆在荷△　王　烨△△　李银宽△　范国锋△△△(辛集 052360)



方 药 研 究

归脾汤对支气管哮喘的抑制作用研究

河北省辛集市献血办公室

张峰穆在荷△王烨△△李银宽△范国锋△△△(辛集 052360)

提要目的：研究归脾汤对支气管哮喘小鼠的治疗效果。方法：昆明小鼠60只随机分为对照组、哮喘组、低剂量归脾汤治疗组(0.5 g/kg)及高剂量归脾汤治疗组(2.0 g/kg)。以30 μg腹腔注射鸡卵清蛋白和1%鸡卵清蛋白雾化吸入建立慢性哮喘模型。治疗组雾化激发后，连续5 d给予不同剂量归脾汤干预。造模及治疗结束24 h后，检测各组小鼠经不同浓度乙酰甲胆碱激发后的呼气间歇(Penh)值反应气道敏感性；计数支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞；ELISA检测支气管肺泡灌洗液中细胞因子及IgE的浓度；再对支气管肺组织进行组织病理学检查。结果：与哮喘组相比，低剂量治疗组与高剂量治疗组的Penh值明显降低；支气管肺泡灌洗液中Th2相关细胞因子(IL-4, IL-5, IL-13)、IgE及嗜酸性粒细胞含量明显降低(均P<0.05)；治疗组肺及支气管组织中嗜酸性粒细胞明显减少(均P<0.05)。结论：归脾汤对支气管哮喘具有明显抑制作用。

关键词归脾汤；支气管哮喘；气道高反应性；支气管肺泡灌洗液；组织病理学；变态反应

支气管哮喘已经成为严重危害公共健康的疾病，气道慢性炎症被认为在该病发病过程中起着重要作用，[1-3]其主要特点是突发的气道高反应性(AHR)及以嗜酸性粒细胞为主的炎细胞浸润，[4-6]Th2淋巴细胞的激活在哮喘发病过程中发挥着重要作用。[7]被激活的Th2细胞能产生IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子，[7-8]并引起一系列生物学反应，[9-12]导致嗜酸性粒细胞的聚集，从而加重哮喘病情。以往的研究证实抑制Th2所释放的细胞因子可以减轻支气管炎症，从而控制哮喘病情。[8]

由人参、白术、黄芪、当归、茯苓、甘草、远志、酸枣仁、木香、龙眼肉、生姜、大枣等中药组成的归脾汤是一种治疗变态反应性疾病的验方。[13]近年来，常有人报道该方在治疗免疫异常疾病方面的案例,[14]但其在减轻哮喘炎症及症状方面的研究鲜有报道，因此本实验采用归脾汤对支气管哮喘进行治疗，结果发现，归脾汤可以明显改善AHR，有效控制慢性炎症过程。

1资料与方法

1.1实验动物与药物无特定病原体级雄性昆明小鼠60只，6～8周龄，购自河北省实验动物中心[合格证号：1507010]，于室温(22±2)℃、湿度(55±5)%、12 h 昼/夜循环照明环境中饲养，自由摄食、饮水。实验过程符合河北省实验动物伦理委员会规定。归脾汤丸剂购自河北神威药业有限公司，并以2 g/mL浓度溶解于25℃的蒸馏水中。

1.2实验动物模型的制备60只实验小鼠被随机分为4组: ⑴ 对照组(10只)以等渗盐水致敏，实验期间饲以蒸馏水；⑵ 鸡卵清蛋白(OVA)组即哮喘组(10只)先以30 μg OVA胸腔内注射致敏，在实验第36～40天以1% OVA鼻内雾化吸入激惹，实验期间饲以蒸馏水；⑶ 低剂量归脾汤组(20只)先以OVA致敏并激惹，在实验第41～45天以胃管灌入0.5 g/kg的归脾汤液；⑷ 高剂量归脾汤组(20只)先以OVA致敏并激惹，在实验第41～45天以胃管注入2.0 g/kg的归脾汤液。

1.3AHR检测在试验结束后24 h，各组小鼠雾化吸入 6.25～50 mg/mL的乙酰甲胆碱以激发，用无创性小鼠肺功能仪测定不同浓度下增强的呼气间歇(Penh)值，Penh=(增强呼气间歇时间)×(PEP/PIP)。

1.4支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子、IgE及嗜酸性粒细胞的测定在AHR检测完成后，以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉并处死小鼠，然后以2 mL生理盐水冲洗肺支气管3次，收集BALF液，室温3 000 r/min离心5 min，取上清液送检验科以酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定IL-4、IL-5、IL-13及IgE的表达，取沉淀物湿法制片后计数嗜酸性粒细胞。

1.5肺及气管组织病理学检查分离肺及气管，10%中性福尔马林液固定1周，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制备层厚5 μm的组织切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察并计数嗜酸性粒细胞。

1.6统计学方法应用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，实验数据均以均值±标准差的形式表示，以组间比较用Bonferroni方差分析和卡方分析进行统计。

2结果

2.1归脾汤对AHR的影响4组小鼠雾化吸入6.25～50 mg/mL 的乙酰甲胆碱后，AHR的检测结果显示，当吸入浓度为0～25 mg/mL时，4组小鼠的penh值差异无显著性；当吸入浓度为50 mg/mL时(最高浓度)，OVA组小鼠的penh值与对照组、低剂量归脾汤组及高剂量归脾汤组的差异均有显著性(P<0.05)，但低剂量归脾汤组的penh值与高剂量归脾汤组间差异无显著性(P>0.05)。提示归脾汤能明显抑制卵清白蛋白所诱导的AHR，详见图1。

图1　乙酰甲胆碱吸入后各组间Penh的改变

2.2各组归脾汤对BALF中Th2细胞因子及IgE的影响比较收集BALF的上清液对Th2细胞释放的IL-4、IL-5、IL-13及IgE因子进行检测。与对照组小鼠相比，OVA组的IL-4 、IL-5 、IL-13均明显高于对照组(均P<0.05)；与OVA组小鼠相比，低、高剂量归脾汤组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IgE浓度明显降低，且差异有显著性(均P<0.05)，低剂量归脾汤组小鼠BALF中IL-4、IL-5的浓度降低更为明显，差异有显著性(P<0.05)；与低剂量归脾汤组比较，高剂量归脾汤组小鼠BALF中IL-13及IgE浓度明显降低，而且差异有显著性(均P<0.05)，详见表1。

2.3归脾汤对BALF中嗜酸性粒细胞的影响取BALF离心沉淀物，湿法制片并进行HE染色，在生物显微镜下计数嗜酸性粒细胞，以嗜酸性粒细胞数/500BALF细胞表示，结果显示OVA组嗜酸性粒细胞百分比为37.9%，明显高于对照组；而服用归脾汤后，无论是低剂量组(5.2%)还是高剂量组(18.1%)的嗜酸性粒细胞百分比均明显低于OVA组，且差异具有显著性(P<0.05)。

2.4归脾汤对肺组织内嗜酸性粒细胞的影响用生物显微镜观察小鼠肺组织病理切片，随机选取10个视野计数浸润的嗜酸性粒细胞，结果以每mm2嗜酸性细胞总数来表示。结果显示，OVA组肺组织中嗜酸性粒细胞计数(51.1±1.2/HPF)明显高于低剂量归脾汤组(23.4±2.1)和高剂量归脾汤组(4.8±2.1/HPF)P<0.05，差异有显著性。

表1　各组小鼠Th2细胞因子和IgE值 　　 　

注：与对照组比较，*P<0.05；与OVA组比较，#P<0.05；与低剂量归脾汤组比较,△P<0.05

3讨论

支气管哮喘的发病机制包括Th2淋巴细胞及其所释放的细胞因子，还包括发挥着重要作用的气道炎症。当患者吸入过敏原后，Th2淋巴细胞通过释放IL-4、IL-5及IL-13等细胞因子,[15]不仅加强了AHR，而且增加了炎细胞浸润(如嗜酸性粒细胞)和IgE分泌。[16]笔者研究显示，哮喘模型鼠中同样发生了上述病理改变。此外，有人用Th2细胞因子刺激细胞因子基因敲除小鼠后发现支气管哮喘症状明显加重，[17-18]间接证明上述观点。笔者实验证实归脾汤对哮喘小鼠AHR及Th2细胞因子表达具有药理学作用。卵清蛋白致敏的哮喘小鼠AHR明显增高，IgE以及肺嗜酸性粒细胞表达增加；应用归脾汤后，各项指标均明显降低，这种改善作用部分依赖于药物浓度的变化。

IL-5对嗜酸性粒细胞的分化、成熟及存活起着非常重要的作用，能促进嗜酸性粒细胞向炎症部位的回归。[10，12]有研究认为IL-5缺失小鼠即便受到抗原刺激也不会产生AHR和嗜酸性粒细胞聚集，[19-20]抗IL-5治疗可以明显降低哮喘小鼠的AHR，减少其体内的嗜酸性粒细胞含量。[20-21]临床研究也证实抗IL-5治疗能够通过改变嗜酸性粒细胞含量，显著改善一部分重症哮喘患者的病情。[22-23]本研究显示，归脾汤同样能通过降低BALF和肺组织中的IL-5，达到控制嗜酸性粒细胞增殖的作用。尽管归脾汤的详细药理机制还有待深入研究，但我们的结果显示：归脾汤可以通过降低Th2细胞因子水平及嗜酸性粒细胞数量来发挥其抗哮喘作用。

IL-4不仅能够促进Th2细胞的成熟与分化，还能刺激B细胞分泌IgE。[10，23]反之，抑制IL-4能够减轻哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞的浸润和IgE的分泌，[24]另有研究显示IL-4缺失小鼠不会患支气管哮喘和支气管炎，[25]提示IgE的产生与IL-4的刺激密切相关。Th2细胞因子(尤其是IL-4)是支气管哮喘和嗜酸性粒细胞的关键调节因子，还有证据表明嗜酸性粒细胞含量与AHR和哮喘严重程度密切相关。笔者的研究证实归脾汤能够有效地减少哮喘小鼠BALF中IgE和IL-4表达，肺的组织病理学检查显示归脾汤能抑制嗜酸性粒细胞在肺组织中的浸润。这些结果均提示归脾汤能够通过下调IL-4而降低支气管哮喘小鼠的IgE水平，该方剂对IL-4的抑制作用还能够减轻肺嗜酸性粒细胞浸润和AHR。

归脾汤作为一种著名的传统中药方剂，被应用于临床已经有数百年的历史了，其在变态反应性疾病的治疗中发挥着重要的免疫调节作用。前人的临床研究显示用归脾汤具有明显的抗炎作用，可以治疗过敏性紫癜、变应性鼻炎等免疫性疾病，能够降低血清中IgE、PGE2、LTC的浓度。[13]它还可以通过抑制CD4+T细胞，降低小鼠血清中IgE水平。[26]与临床治疗结果相符的是，口服归脾汤能够降低I型变态反应小鼠体内IgE的产生和组胺的释放。[27]笔者的实验结果表明归脾汤能降低AHR，减轻哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润，这种治疗作用是通过降低Th2细胞因子及IgE来实现的。但是由于中药方剂中化学成分极其复杂，笔者尚不能确认哪一种(些)化学成分发挥了上述抗炎作用。

总之，归脾汤能够通过降低AHR和气道嗜酸性粒细胞浸润而有效控制变态反应性哮喘小鼠的病情，其潜在的药理学机制尚需要进一步的研究。

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(2016-01-04收稿)

中图分类号：R285.6

文献标识码：A

文章编号：1007-5615(2016)02-0042-04

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