黄芪甲苷抑制缺氧缺糖复氧复糖PC12细胞凋亡的研究*

承德医学院病理生理学教研室

李会哲　周晓红△　靳晓飞　高维娟△(承德 067000)



实 验 研 究

黄芪甲苷抑制缺氧缺糖复氧复糖PC12细胞凋亡的研究*

承德医学院病理生理学教研室

李会哲周晓红△靳晓飞高维娟△(承德 067000)

提要目的：研究黄芪甲苷对缺氧缺糖复氧复糖PC12细胞凋亡的抑制作用。方法：取对数期PC12细胞随机分为6组：正常对照组(Normal组)、黄芪甲苷溶剂对照组(DMSO组)、模型组(缺氧缺糖复氧复糖组，Model组)、黄芪甲苷高剂量组( AST H组，100 μmol/L)、 黄芪甲苷中剂量组( AST M组，50 μmol/L)、黄芪甲苷低剂量组(AST L组，25 μmol/L)。正常对照组正常培养不进行任何处理；其余各组均进行缺氧缺糖复氧复糖造模：缺氧缺糖4 h后复氧复糖24 h；黄芪甲苷各剂量组和溶剂对照组于造模前0.5 h给药，直至培养结束。用MTT方法检测细胞存活率，倒置显微镜下观察细胞的形态，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与正常组相比，模型组细胞折光性差，细胞肿胀簇状聚集，甚至脱落，细胞之间的突触消失，细胞本身明显肿胀，存活率明显降低，细胞凋亡率增加(P<0.05)。与模型组相比，溶剂对照组和黄芪甲苷低剂量组细胞形态无明显变化，存活率和凋亡率差异没有显著性(P>0.05)，但黄芪甲苷高、中剂量组细胞肿胀等变化明显减轻，存活率均增加，细胞凋亡率降低(P<0.05)。黄芪甲苷高剂量组比中、低剂量组细胞存活率高和凋亡率低(P<0.05)。结论：黄芪甲苷可抑制PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖后的损伤和凋亡，其最佳作用浓度是100 μmol/L。

关键词黄芪甲苷；中风；PC12细胞；细胞凋亡；缺氧缺糖复氧复糖；细胞存活率

缺血性脑血管病具有高发病率、高致残率、高死亡率，是危害人们健康的疾病之一。[1]脑缺血再灌注损伤是缺血性脑血管病的重要病理过程，其中细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤的发生机制中起着关键的作用。[2]实验证实中药黄芪具有抑制大鼠神经元细胞凋亡、减轻脑缺血再灌注损伤的作用。黄芪甲苷Ⅳ作为其有效活性成分，对脑缺血再灌注损伤有保护作用。[3]笔者通过建立PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖模型，模拟神经细胞缺血再灌注损伤，用黄芪甲苷进行干预，在细胞水平上研究黄芪甲苷对PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖后凋亡的影响，并探讨黄芪甲苷的最佳作用浓度，为深入研究黄芪防治脑缺血再灌注损伤的作用机制奠定基础。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1药物和细胞：黄芪甲苷购自上海士峰生物科技有限公司，纯度≥98%(生产批号：15010913)，PC12细胞由河北医科大学第一医院科研中心许顺江教授惠赠。

1.1.2试剂和仪器：RPMI1640购自GIBCO公司，青霉素-链霉素和0.25%胰酶购于BIOND公司，胎牛血清购自PAR公司，马血清购自BI公司，无糖EBSS缓冲液购自LEAGENE公司，DMSO购自TCI公司， Annexin/Pl双染试剂盒：BD公司。倒置显微镜DMI3000B型购自徕卡公司，普通培养箱3111型和三气培养箱3131型购自赛默尔菲公司，超净工作台SW-CJ-ID型购自苏州净化公司，低速离心机80-2型购自江苏金坛市金城实验仪器厂，流式细胞仪FACSAria II型购自BD公司。

1.2方法

1.2.1PC12细胞培养方法： PC12细胞以含10%胎牛血清，5%马血清，1%双抗的RPMI1640培养基于37℃，5%CO2及饱和湿度下的培养箱中培养，2天换液1次，待细胞融合后进行传代。

1.2.2PC12细胞造模及实验分组：参照Bossenmyer[4]和Kikuchi k[5]的方法建立缺氧缺糖复氧复糖细胞模型：PC12细胞移除原培养基换用无糖Earle＇s液，随即把培养瓶放入37℃，94%高纯N2，5%CO2三气培养箱中培养4 h后，换正常培养基放入37℃，5%CO2及饱和湿度下的培养箱中培养24 h。正常对照组正常培养，不进行任何处理；黄芪甲苷各剂量组和溶剂对照组均于造模前0.5 h给药，直至培养结束。取对数期PC12细胞，随机分为6组：正常对照组(Normal组)、溶剂对照组(DMSO浓度不超过培养基浓度的1‰)、模型组(缺氧缺糖复氧复糖组，Model组)、黄芪甲苷高剂量组(AST H组，100 μmol/L)、中剂量组(AST M组，50 μmol/L)、低剂量组(AST L组，25 μmol/L)。

1.2.3MTT法检测细胞存活率及细胞的形态学观察：将各组细胞以1×104个/mL接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL培养基，各组处理同上，复氧复糖培养24 h后，立即在倒置显微镜下观察各组PC12细胞的形态，随后将每孔加入MTT(终浓度为5 mg/mL)10 μL，37℃培养箱孵育4 h，之后小心吸弃溶液，注意勿将结晶吸除；每孔加入150 μL DMSO，室温摇晃震荡10 min，待沉淀物充分溶解后用酶标仪490 nm处测定各孔吸光度值；细胞存活率以正常组吸光度值的均数为100%，计算公式如下：

存活率(%)=(A实验-A空白)/(A对照-A空白)×100%

1.2.4Annexin/Pl双染鉴定PCI2细胞凋亡：各组细胞悬液的制备，调整细胞密度为1×106/mL，将旧的细胞培养液及胰酶消化后的细胞全部转移入离心管中，2 000 r/min离心5 min，将凋亡细胞尽量离心下来，弃去培养液，细胞用预冷PBS洗2次，2 000 r/min离心5 min，用100 μL结合缓冲液重悬细胞,加入5 μL Annexin V和5 μL PI混匀后于室温避光孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测分析。

2结果

2.1黄芪甲苷对PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖后存活率的影响与正常对照组相比，模型组细胞存活率明显降低(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷高、中剂量组细胞存活率均增加(P<0.05)，但黄芪甲苷低剂量组和溶剂对照组细胞存活率没有明显差异(P>0.05)；黄芪甲苷3个剂量组两两比较细胞存活率差异均有显著性(P<0.05)，而高剂量是增加细胞存活率最佳有效剂量。见图1。

2.2PC12细胞的形态学观察正常对照组高分化型PC12细胞为多角形，锥形，细胞有突触，突触之间互相连接形成网状结构，细胞膜完整并且光滑，里面很少的圆形为未分化形且没有贴壁的细胞，折光性很强。模型组细胞折光性明显很差，细胞严重皱肿胀为圆形并且成簇状聚集，甚至脱落，细胞之间的突触消失，细胞本身明显肿胀。黄芪甲苷高、中剂量组的细胞得到改善并且向正常细胞的状态生长。溶剂组和黄芪甲苷低剂量组细胞形态与模型组相似。见图2。

图1　PC12细胞存活率的结果

图2各组PC12细胞在倒置显微镜下的形态图(×200)

2.3黄芪甲苷对PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖后凋亡的影响与正常组相比，模型组细胞凋亡率明显升高，差异有显著性(P<0.05)。与模型组相比，溶剂对照组(即DMSO溶剂组)和黄芪甲苷低剂量组细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05)，但黄芪甲苷高、中剂量组细胞凋亡率均降低，差异具有显著性(P<0.05)。黄芪甲苷3个剂量组两两比较细胞凋亡率差异均有显著性(P<0.05)，而高剂量是降低细胞凋亡率最佳有效剂量。详见图3。

图3　流式双染细胞凋亡率结果图

3讨论

缺血性脑血管病是一种能使大脑供血不足，从而导致葡萄糖、氧气、血清等严重缺失，最后造成大脑不可逆损伤的疾病。[6]近年来越来越多的报道指出在脑缺血再灌注损伤中不仅炎症和细胞坏死起着重要作用，而且细胞凋亡同样发挥着举足轻重的作用。[3]

中医理论认为缺血性脑血管病是中风范畴，表现为气血瘀滞，故需要活血化瘀，疏风通络。[7]黄芪在《神农本草经》中记载为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，性温，味甘，具有补气固表，敛疮生肌等功效，中医学认为其用途广泛可用于体弱卫虚，自汗盗汗及气虚血瘀，脑卒中后半身不遂等症状。[8]黄芪甲苷是黄芪最重要的有效成分之一，可以清除脑缺血再灌注损伤炎症瀑布所产生的氧自由基，MDA，NF-κB等[9]从而有效的保护神经细胞免受损害。更能抑制脑缺血再灌注损伤中所产生的casepae-3，bax，Junk-3等细胞因子，抑制大鼠神经元细胞凋亡、减轻脑缺血再灌注损伤，[10-13]并且能增加神经细胞的再生功能，[14]从而降低神经细胞的凋亡。

PC12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞中所分化出来的，分化成为3种类型：未分化型，低分化型和高分化型。由神经生长因子所诱导分化出来的PC12细胞与神经元功能相似具有钙离子通道，电兴奋性和神经交感兴奋性等性能，又称类神经元细胞，因此 PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖模型是人们在体外模拟脑缺血再灌注损伤的常用技术手段，它是在研究保护神经元细胞凋亡机制中的首选细胞。[6]

本实验结果显示，黄芪甲苷可以提高PC12细胞缺氧缺糖复氧复糖后存活率(P<0.05)，减轻细胞形态学损伤性变化，抑制细胞凋亡(P<0.05)，其发挥作用的最佳浓度为100 μmol/L。

参考文献

[1]Bousser M G. Antithrombotic agents in the prevention of ischemic stroke[J]. Cerebrovascular Diseases, 2009, 27 Suppl 3: 12-9

[2]ChoY S, Shin M S, Ko I G, et al. U.linastatin inhibits cerebral ischemia-induced apoptosis in the hippocampus of gerbils[J]. Molecular Medicine Reports, 2015, 12(2)：1 796-1 802

[3]Yan-Yan Yin, Wei-Ping Li, Hui-Ling Gong, et al. Protective Effect of Astragaloside on Focal Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury in Rats[J]. American Journal of Chinese Medicine, 2012, 38(3): 517-527

[4]Bossenmeyer C, Chiha R, Muller S, et al. Hypoxia/reoxigenation induces apotosis through biphasic induction of potein synthesis in cutured rat brain nureons[J]. Brain Res, 1998, 787(1): 107-116

[5]K Kikuchi, K Kawahara, K K.Biswas, et al. Minocycline attenuates both OGD-induced HMGB1 release and HMGB1-induced cell death in ischemic neuronal injury in PC12 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 385(2): 132-136

[6]Jun-Rong Z, Yi-Fu T, Shen L, et al. Protective effects of ginsenoside Rb(3) on oxygen and glucose deprivation-induced ischemic injury in PC12 cells[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2010, 31(3): 273-280

[7]王北松. 缺血性脑血管病研究近况与中医治疗概略[J]. 中医药信息， 2001，18(3)：2-4

[8]陈国辉，黄文凤. 黄芪的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国新药杂志，2008，17(17)：1 482-1 485

[9]Shao A, Guo S, Tu S, et al. Astragaloside IV alleviates early brain injury following experimental subarachnoid hemorrhage in rats[J]. International Journal of Medical Sciences, 2014, 11(10): 1 073-1 081

[10]Liu G, Song J, Guo Y, et al. Astragalus injection protects cerebral ischemic injury by inhibiting neuronal apoptosis and the expression of JNK3 after cerbral ischemic reperfusion in rats[J]. Behavioral & Brain Functions, 2013, 9(5): 443-453

[11]刘莎莎，高维娟，钱涛，等. 黄芪注射液对脑缺血/再灌注大鼠海马神经元Caspase-3表达的影响[J]. 中国药理学通报，2012，28(6)：867-871

[12]焦俊霞，高维娟，李玉明，等. 黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2和Bax表达的影响[J]. 中国病理生理杂志，2011，27(5): 905-910

[13]孙念霞, 高维娟. 黄芪防治缺血性脑血管病的作用机制研究进展[J]. 河北中医药学报, 2014(1):51-54

[14]Zhang X, Chen J. The mechanism of astragaloside IV promoting sciatic nerve regeneration[J]. Neural Regeneration Research, 2013, 8(24): 2 256-2 265

(2016-04-11收稿)

Study on Astragaloside IV Inhibiting PC12 Apoptosis Induced byOxygen-glucose Deprivation and Restoration

Pathophysiology Department, Chengde Medical College

LIHui-zheZHOUXiao-hongJINXiao-feiGAOWei-juan(Chengde 067000)

AbstractObjective: to study the inhibition of Astragaloside IV on PC12 apoptosis induced by oxygen-glucose deprivation and restoration. Methods: PC12 cells of logarithmic phase were divided randomly into six groups: Normal group, DMSO group (Astragaloside IV solvent), Model group (Oxygen-glucose Deprivation and Restoration), ASTH group (high dose of Astragaloside IV, 100 μmol/L), ASTM group (medium dose, 50 μmol/L), and ASTL group (low dose, 25 μmol/L). Normal group were cultivated normally without any processing, while the others were making models with oxygen-glucose deprivation and restoration: 4 hours’ deprivation before restoring oxygen and glucose for 24 hours; administrations to all dose groups and DMSO group started 0.5 hour before model making and it didn' t stop till the end of cultivation. Cell survival rate was detected with MIT, cell morphology observed under the inverted microscope, and cell apoptosis detected with flow cytometer. Results: compared with normal group, cells of model group had inferior refraction, swelling, clustering even ablating; synapses between cells disappeared, the survival rate significantly decreased and the apoptotic rate increased (P<0.05). Compared with model group, the morphology had no obvious changes in DMSO group and all dose groups, and there was no significant difference in survival rate and apoptotic rate (P>0.05), but in ASTH and ASTM groups, cells were less swelling, the survival rate decreased and the apoptotic rate decreased (P<0.05). Of ASTH group, the survival rate was higher and the apoptotic rate was lower than those of ASTM and ASTL group (P<0.05). Conclusion: Astragaloside IV can inhibit the injury and apoptosis of PC12 induced by oxygen-glucose deprivation and restoration, and the best activity is 100 μmol/L.

Key wordsAstragaloside IV;stroke; PC12; apoptosis; oxygen-glucose deprivation and restoration; cell survival rate

通讯作者：高维娟，女，医学博士,教授，博士研究生导师。

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1007-5615(2016)02-0001-04

*河北省应用基础研究计划重点项目：No.16967756D； 河北省科技支撑计划项目：No.13272504D；河北省普通高校高层次人才科学研究计划项目：No.GCC2014031

△河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治重点实验室