痛泻要方对大鼠溃疡性结肠炎IL-6、IL-4 mRNA血清含量的影响

北京门头沟疾病预防控制中心

刘海涛　张　丽△(北京102300)



痛泻要方对大鼠溃疡性结肠炎IL-6、IL-4 mRNA血清含量的影响

北京门头沟疾病预防控制中心

刘海涛张丽△(北京102300)

提要目的：观察痛泻要方治疗大鼠溃疡性结肠炎(UC)白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素4(IL-4)含量变化，探讨其治疗UC的作用机制。方法: 将UC大鼠动物模型随机分成正常对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶组(SASP)和痛泻要方组，观察大鼠结肠黏膜损伤指数，检测IL-6、 IL-4含量变化。结果: 痛泻要方能有效改善UC大鼠结肠组织的病理损伤，与模型组比较， 痛泻要方组IL-6水平显著减低， IL-4水平升高。结论: 痛泻要方治疗溃疡性结肠炎疗效明显，其治疗作用与调节UC大鼠炎性因子密切相关。

关键词痛泻要方; 溃疡性结肠炎;白细胞介素6；白细胞介素4；腹痛；腹泻；黏液脓血便

溃疡性结肠炎(UC)是一种病变位于直肠和结肠的慢性非特异性炎症，其临床表现以腹痛、腹泻为主，腹泻多为黏液脓血便。[1]UC的常规治疗停药后易复发, 用药副反应多, 部分顽固性病例疗效不佳。[2]近些年来，中医药治疗溃疡性结肠炎取得一定进展，[3]其中，痛泻要方能明显减轻溃疡性结肠炎黏膜损伤，促进溃疡修复。本实验从痛泻要方对UC大鼠IL-6和IL-4 mRNA血清水平变化的角度，探讨痛泻要方治疗UC与炎性因子IL-6和IL-4的相关性。

1材料与方法

1.1实验动物选用雄性健康SPF级SD大鼠40只, 体质量( 180±20) g，购自北京通华实验动物技术有限责任公司。

1.2 中药成分及药物组成痛泻要方依据方剂学《丹溪心法》原方取白术、白芍、陈皮、防风，比例为6︰4︰3︰2。将白术、陈皮、防风加10倍水以旋转蒸发仪回流提取挥发油2 h，过滤，药物残渣再加8倍水，继续提取1 h。药物残渣再与白芍加8倍量水煎煮。收集挥发油，低温密封贮藏。所得的水提液加75%乙醇等量混合，静置24 h，过滤，浓缩，贮藏。水提滤液与挥发油合并，制备成混悬液。柳醋氮磺胺吡啶肠溶片(SASP, 批号: 20150206), 购自上海中西三维药业有限公司。制成0.203 g/mL 的混悬液。

1.3方法

1.3.1UC模型建立：大鼠UC模型的制备采用Morris等[4]报道方法, SD大鼠禁食(不禁水)48 h后, 腹腔麻醉大鼠后，手提大鼠尾部，使大鼠倒立，将100 mg/kg TNBS和0.25 mL乙醇(50%)溶液缓缓注入大鼠结肠部位，距肛门缘7～8 mm。正常对照组注入等体积的0.9%氯化钠生理盐水。实验大鼠术后常规饲养。

1.3.2实验分组及给药：造模成功的SD大鼠按体质量随机分为痛泻要方组、柳氮磺胺吡啶(SASP)阳性药组、模型组和正常对照组, 每组10只。给药途径为灌胃给药，痛泻要方组按照2.0 g/kg给药，阳性药SASP混悬液组按0.5 g/kg给药, 正常对照组和模型组按0.9%氯化钠生理盐水10 mL/kg灌胃, 每日1次, 连续10天。[5]

1.4指标检测

1.4.1大鼠结肠黏膜损伤指数评分：给药10 d后，处死SD大鼠后观察结肠黏膜损伤情况，按文献[6]评分记录结肠黏膜损伤指数。

1.4.2大鼠血清IL-6，IL-4水平的测定：给药10 d后，处死SD大鼠后行主动脉取血，EDTA抗凝，离心机3 000 r/min，离心5 min后收集血清，IL-6、IL-4血清检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

1.4.3大鼠结肠组织IL-6、IL-4 mRNA水平测定：结肠组织用TRlzol试剂提取组织总RNA，逆转录后检测IL-6、IL-4 mRNA水平，β-actin为内参。引物序列为：β-actin上游引物5'-CACCCTTCCTTCTTGGGTAT-3',下游引物5'- TGGCATAGAGGTCTTTACGG-3'; IL-4上游引5'-CAGAAAAAGGGACTCCATGCACCG-3' ，下游引物5'-TTGCGAAGCACCCTGGAAGCC-3'; IL-6上游引物5'-ACCACGGCCTTCCCTACTTC -3',IL-6下游引物5'-CATTTCCACCATTTCCCAGA -3'。反应条件如下： 50 ℃ 30 min；93℃ 30 s，56℃ 350 s，72℃ 1 min， 循环40次。

1.5统计学方法所有资料用SPSS13.0统计软件进行分析，组间比较采用t 检验，P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1大鼠结肠黏膜损伤指数结果观察大鼠结肠组织病理变化发现，模型组大鼠结肠黏膜有发生黏连，结肠壁增厚、肿胀的现象，可见糜烂、充血，局部可见溃疡面。与正常对照组相比，模型组大鼠结肠黏膜损伤指数明显升高(P<0.01)；与模型组比较，痛泻药方和SASP组大鼠结肠组织损伤指数均降低(P<0.01)；SASP组与痛泻药方组比较，差异无显著性(P>0.05) 。详见表1。

2.2大鼠血清IL-6、IL-4水平结果与正常对照组相比，模型组大鼠血清IL-6水平明显升高( P<0.05) ，IL-4水平明显降低( P<0.05)；与模型组比较，SASP组、痛泻药方能明显降低血清IL-6水平(P<0.05)，升高IL-4水平(P<0.05)；SASP组和痛泻药方组差异无显著性(P> 0.05) 。详见表2。

组别例数剂量/g·kg-1结肠黏膜损伤指数正常对照组10—0.00±0.00 模型组10—4.25±0.23## SASP组100.53.05±0.12**痛泻药方组102.03.12±0.22**

注：与正常对照组比较，##P<0.01； 与模型组比较，**P<0.01

表2各组大鼠IL-6、IL-4血清水平比较结果

组别例数IL-6/ng·L-1IL-4/ng·L-1正常对照组1095.21±11.2143.24±0.92模型组10121.01±11.56#25.23±0.15#SASP组1076.21±8.56*35.05±0.12*痛泻药方组1078.01±7.46*35.12±0.22*

注：与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

2.3大鼠结肠组织中IL-6、IL-4的mRNA表达水平结果与正常对照组相比，模型组大鼠IL-6 mRNA水平明显升高(P<0.05) ，IL-4 mRNA水平明显降低(P<0.05)； 与模型组比较，SASP组、痛泻药方能明显降低大鼠IL-6 mRNA水平 (P<0.05) ，升高IL-4 mRNA水平 (P<0.05); SASP组和痛泻药方组组间比较，差异无显著性(P>0.05)。详见表3。

表3各组大鼠IL-6、IL-4 mRNA表达比较结果

组别例数IL-6/β-actinmRNAIL-4/β-actinmRNA正常对照组100.631±0.012 0.835±0.012 模型组100.983±0.015# 0.531±0.011# SASP组100.521±0.018*0.685±0.018*痛泻药方组100.513±0.012*0.695±0.015*

注：与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

3讨论

溃疡性结肠炎(UC)是一种累及肠道的慢性非特异性炎症性疾病，病变以炎症和溃疡为主，病变部位多局限于结肠和直肠的黏膜及黏膜下层。氨基水杨酸制剂和糖皮质激素是目前常用药物，但治疗效果往往不理想，易反复发作、容易恶化和癌变，给患者带来极大痛苦，本病已经被列为难治性消化病之一。[7]近几年研究发现，在中医辨证论治思想的指导下，中医药治疗UC疗效显著。进一步实验研究发现，[8]痛泻要方对肝气郁结，肝郁脾虚UC患者治疗效果明显。

IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，其作用主要表现为对多种细胞促炎作用和诱导肝组织产生急性反应蛋白等。IL-4是一种抗炎因子，通过刺激B细胞和T细胞，下调炎性介质包括TNFα和IL-1等，发挥免疫抑制效应。[9-10]

本实验通过UC动物模型的构建发现，模型组大鼠IL-6 mRNA水平和血清水平显著升高，IL-4 mRNA水平和血清水平显著降低; 而经过治疗后的SASP组、痛泻药方组大鼠IL-6 mRNA水平和血清水平显著降低，IL-4 mRNA水平和血清水平显著上升，说明促炎因子的大量聚集, 抑炎因子的减少与溃疡性结肠炎进展相关，这与刘建平等[11]报道的泄浊解毒方对UC模型治疗效果一致。痛泻要方对溃疡性结肠炎的治疗作用与调节UC炎性因子相关，其通过抑制多种炎症细胞因子的释放和表达发挥抗炎作用，但其炎症细胞因子的激活通路有待进一步研讨。

参考文献

[1] Chow DK, Leong RW, Tsoi KK, et al. Long-term follow-up of ulcerative colitis in the Chinese population [J]. Am J Gastroenterol, 2009, 104 (30):647-654

[2]Ukil A, Maity S, Das PK. Protection from experimental colitisby theaflavin-3,3'-digallate correlates with inhibition of IKK and NF-κB activation [J]. Br J Pharmacol, 2006,149(1): 121-131

[3]魏江山, 杜位良.中医药治疗溃疡性结肠炎研究概况[J].亚太传统医药，2016，12(6) : 70 -71

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[7]杨名诗，龙友明，崔淑兰.葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎小鼠NF-κB 活性及其对ICAM-1表达的调控[J].南方医科大学学报，2008，28(4) : 600-605

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[11]刘建平，任 杰，郞晓猛,等.泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-4、IL-6影响[J]. 河北中医药学报，2014，29( 3) : 7-8

(2016-04-11收稿)

Effect of Tongxie Yaofang on IL-6 and IL-4 mRNA Contents in UC Rats

Mentougou Center for Disease Control and Prevention, Beijing

LIUHai-taoZHANGLi(Beijing 102300)

AbstractObjective: To observed the IL-6 and IL-4 mRNA content changes in UC rats treated with Tongxie Yaofang, and to explore its functional mechanism. Methods: The UC rats were randomly divided into control group, model group, SASP group and Tongxie Yaofang group. The colonic mucosal injury index was observed, and the IL-6 and IL-4 mRNA contents detected. Results: Tongxie Yaofang could improve effectively the pathological injury of colonic issues in UC rats. Compared with model group, IL-6 of Tongxie Yaofang group decreased significantly and IL-4 increased. Conclusion: Tongxie Yaofang is effective in treating UC, whose therapeutic action is closely related to regulating the inflammatory factors in UC rats.

Key wordsTongxie Yaofang; UC (ulcerative colitis); IL-6; IL-4; abdominal pain; diarrhea; mucopurulent feces

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1007-5615(2016)02-0004-03

△北京航天中心医院(北京100049)