白细胞介素-4对原代星形胶质细胞炎症因子的影响*

杨　茜，单明慧，杨　明，苏炳银，李淑蓉△

1.成都医学院 病理学与病理生理学教研室(成都　610500);2.发育与再生四川省重点实验室 (成都　610500)



白细胞介素-4对原代星形胶质细胞炎症因子的影响*

杨茜1，单明慧2，杨明1，苏炳银2，李淑蓉1△

1.成都医学院 病理学与病理生理学教研室(成都610500);2.发育与再生四川省重点实验室 (成都610500)

【摘要】目的探讨白细胞介素-4(IL-4)对星形胶质细胞炎症因子释放的影响。方法选取新生1～2 d的C57乳鼠，取大脑皮层制备原代星形胶质细胞，传代3次，检测星形胶质细胞纯度，IL-4刺激后，用Q-PCR来检测多种炎症因子的释放。结果原代培养的星形胶质细胞纯度高达95%，用IL-4刺激后，抗炎因子ARG1、CD206、TGFβ、IFNβ、IL-10表达升高，促炎因子TNFα、IL-6表达降低。结论IL-4对星形胶质细胞抗炎因子的分泌有促进作用，对促炎因子的分泌有抑制作用。

【关键词】星形胶质细胞；IL-4；炎症因子

星形胶质细胞是中枢神经系统中分布最广泛的细胞，在分泌营养物质、调节神经元微环境等各方面均发挥着重要功能[1-2]，参与了多种神经系统疾病的病理过程。星形胶质细胞在调节免疫功能中通过产生炎症细胞因子来发挥重要作用[3]。白细胞介素-4(IL-4)的作用有刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞，同时，在调节适应性免疫和体液免疫中起关键作用。IL-4能刺激小胶质细胞向M2表型分化，产生炎症抑制因子，也能抑制单核细胞IL-1、TNF和IL-6的产生。因此，探讨IL-4对星形胶质细胞是否具有类似对巨噬细胞的效应，对了解星形胶质细胞的炎症反应提供帮助。

1材料与方法

1.1主要试剂与设备

DMEM/F12培养基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、胰酶(Gibco)、双抗(Gibco)、IL-4(R&D)、多聚甲醛(Sigma)、BSA(Sigma)、DEPC(Sigma)、GFAP抗体(中杉金桥)、羊抗兔IgG/HRP(中杉金桥)、real-time PCR试剂盒(罗氏)、二氧化碳培养箱(BioRad)、PCR仪(BioRad)、CFX96 real-time system (BioRad)、倒置显微镜(Olympus)。

1.2星形胶质细胞的原代培养

取出生后1～2 d的C57乳鼠，置于75%乙醇中浸泡3 min，在超净台内断头，剪开头骨，取出双侧大脑皮质，置于盛有预冷的D-Hank′S液培养皿内，剥离脑膜和血管组织，然后将大脑皮质移至另一培养皿内，并用D-Hank′S液冲洗2次。在培养皿内，将其剪成碎组织块，移入离心管中，加入适量DMEM/F12培养液，反复吹打，产生均一的细胞悬液。将该细胞悬液注入培养瓶中，使细胞悬液均匀布满培养瓶底部，继而每瓶中加入约5 mL完全培养基(DMEM/F12，10%FBS，双抗)，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，差速黏附处理30 min，此步用来去除成纤维细胞成分。然后，翻转培养瓶，吸取细胞悬液接种至另一培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔3 d换液1次，培养9～10 d，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长满并单层铺满瓶底后，进行消化传代。

1.3星形胶质细胞的鉴定

将传代的细胞接种于24孔板内，孔内预先放涂有多聚赖氨酸的盖玻片，37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育24 h后，进行GFAP免疫组化显色，用CD11b标记小胶质细胞，观察星形胶质细胞纯度。

1.4IL-4处理星形胶质细胞并用RT-PCR测定炎症因子的mRNA水平

不经过任何处理的原代培养的星形胶质细胞为对照组，用IL-4(20 ng/mL) 处理24 h的星形胶质细胞为实验组，TRIZOL 法抽提细胞总RNA，逆转录合成 cDNA。根据罗氏试剂盒说明书进行Q-PCR， 分别观察抑炎因子ARG1、CD206、TGFβ、IFNβ、IL-10以及促炎因子TNFα、IL-6的表达。

1.5统计学方法

2结果

2.1原代培养的星形胶质细胞的鉴定

星形胶质细胞每次传代时，取少量细胞种植于用多聚赖氨酸包被的玻片上，24 h后于镜下观察细胞贴壁，多聚甲醛固定，进行兔抗GFAP多克隆抗体的免疫细胞化学显色鉴定所培养的细胞，为排除小胶质细胞的干扰，也用CD11b进行鉴定。可观察到，培养的细胞几乎均为星形胶质细胞(图1)，小胶质细胞非常少(图2)。传代3次后，星形胶质细胞纯度计数高达95%。

2.2IL-4处理后对星形胶质细胞炎症因子mRNA水平的影响

用IL-4(20 ng/mL) 处理原代培养的星形胶质细胞24 h后，可观察到，星形胶质细胞分泌的炎症抑制因子ARG1、CD206的表达均升高；而分泌的炎症促进因子TNFα、IL-6则降低，且差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图1原代星形胶质细胞GFAP表达(×20)

图2原代星形胶质细胞细胞CD11b表达(×10)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3讨论

中枢神经系统各种损伤都能刺激星型胶质细胞活化、增殖，如病理损伤、化学性刺激和疾病等，星形胶质细胞可产生多种营养因子，有着保护作用，但同时过度活化的星形胶质细胞也可释放大量的炎症因子和神经毒素，诱导神经元变性[4]，甚至形成胶质瘢痕，阻碍神经元修复再生的进行。星形胶质细胞也参与了中枢神经系统的免疫反应。当受到与免疫黏附分子有关的细胞接触和黏附，或受到某些细胞因子和抗原抗体复合物刺激后，能分泌众多活性成分，如 IL-6、IL-1、IL-3、TNF-α、NO、LT、白细胞三烯 B4、白细胞三烯 C4 等多种单核细胞趋化及活化因子[5]。小胶质细胞是中枢神经系统中最重要的免疫细胞，在IL-4的刺激下，小胶质细胞能向M2表型转化，分泌ARG1、IL-10、CD206、IFNβ、TGFβ等炎症抑制因子，以拮抗M1型的小胶质细胞。在星形胶质细胞中，是否也具有类似的表现？本实验所测的ARG1、IL-10、CD206、IFNβ、TGFβ等炎症抑制因子是典型的M2型小胶质细胞所分泌的抗炎因子，TNFα是小胶质细胞炎症反应释放的主要的炎性细胞因子，在中枢神经系统病变中起重要作用。TNFα可促进星型细胞和内皮细胞产生趋化因子和黏附分子，并且促进其他炎症细胞因子(IL-1β、IL-6) 的产生，导致炎症的恶性循环[6]。IL-6具有协同加强TNFα的作用[7]。IL-4能抑制单核细胞IL-1、TNF和IL-6的产生，而在星形胶质细胞中，IL-4刺激后，同样能抑制TNFα和IL-6的产生。星形胶质细胞和单核巨噬细胞的来源大相径庭，却在炎症反应方面，与巨噬细胞来源的小胶质细胞有着一定的相似度，具体机制尚有待探讨。但不可否认的是，IL-4能刺激星形胶质细胞分泌更多的炎症抑制因子以及能抑制星形胶质细胞分泌促炎因子，在一定程度上促使星形胶质细胞发挥着对中枢神经系统的保护作用。

参考文献

[1] Azevedo FA, Carvalho LR, Grinberg LT,etal. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain[J]. The Journal of Comparative Neurology, 2009, 513(5):532-541.

[2] Grumet M, Hoffman S, Chuong CM,etal. Polypeptide components and binding functions of neuron-glia cell adhesion molecules[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81(24):7989-7993.

[3] Cerbai F, Lana D, Nosi D,etal. The neuron-astrocyte-microglia triad in normal brain ageing and in a model of neuroinflammation in the rat hippocampus[J]. PLoS One, 2012, 7(9):45250.

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[5] Esendagli G, Kurne AT, Sayat G,etal. Evaluation of Th17-related cytokines and receptors in multiple sclerosis patients under interferon β-1 therapy[J]. J Neuroimmunol, 2013, 255(1-2):81-84.

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[7] Street ME，Miraki-Moud F，Sanderson IR，etal．Interleukin-1beta (IL-1beta) and IL-6 modulate insulin -like growth factor-binding protein (IGFBP) secretion in colon cancer epithelial (Caco-2) cells[J].J Endocrinel，2003，179(3) : 405-415.

The Effect of Interleukin-4 on the Release of Inflammatory Factors in Primary Astrocytes

YangXi1,ShanMinghui2,YangMing1,SuBingyin2,LiShurong1△.

1.DepartmentofPathologyandPathophysiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SichuanKeyLaboratoryofDevelopmentandRegeneration,Chengdu610500,China

【Key words】Astrocytes; Interleukin-4; Inflammatory factors

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Interleukin-4 on the release of inflammatory factors in primary astrocytes. MethodsPrimary cultures of astrocytes were isolated from the suckling mouse which was born just for one or two days, and the astrocyte purity was detected after the third passages culture. Interleukin-4 was used to stimulate the astrocytes, and then Q-PCR was employed to detect the release of various inflammatory factors. ResultsThe purity of the primary astrocytes was up to 95%. The expressions of anti-inflammatory factors such as ARG1, CD206, TGF β, IFN β and IL-10 increased, while the expressions of pro-inflammatory cytokines such as TNFα and IL-6 decreased. ConclusionInterleukin-4 plays an active role in promoting anti-inflammatory cytokines and inhibiting pro-inflammatory cytokines in primary astrocytes.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.004

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(No:31371215；31540032)

通信作者：△李淑蓉，E-mail：lsrsus@163.com

【中图分类号】R364

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1057.022.html

·论著·