唾液中差异性蛋白在2型糖尿病早期诊断中的临床研究*

许　颖，石　娇，吴东明，周晓萍

成都医学院第一附属医院 检验科(成都　610500)



唾液中差异性蛋白在2型糖尿病早期诊断中的临床研究*

许颖，石娇，吴东明，周晓萍

成都医学院第一附属医院 检验科(成都610500)

【摘要】目的探讨唾液中的胱抑素C(Cys-C)、α2-巨球蛋白(α2-MG)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)及转甲状腺素蛋白(TTR)在2型糖尿病早期诊断中的临床意义及运用。方法选取体检正常人群38例(正常组)，空腹血糖升高患者23例(IFG组)，糖耐量患者31例(IGT组)及2型糖尿病患者86例(2-DM组)，通过免疫印迹检测4组人群唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR蛋白的表达并进行半定量分析。同时通过ELISA方法对唾液及血液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR进行定量分析后研究其相关性。同时，根据ELISA定量结果对Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR绘制ROC曲线，确定各指标检测的特异性和灵敏度。结果免疫印迹条带进行半定量及ELISA定量检测均表明2-DM组患者唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT明显上调，而TTR蛋白无明显变化。唾液及血液中Cys-C、α2-MG、 A1AT及TTR呈正相关，且唾液中Cys-C、α2-MG与血液中血糖浓度呈正相关。ROC曲线表明唾液中Cys-C、α2-MG可作为2-DM早期诊断标志物。结论通过唾液中Cys-C、α2-MG的检测，可在2-DM早期进行筛查，并在糖尿病早期予以干预治疗，具有潜在的临床运用价值。

【关键词】2型糖尿病；唾液；胱抑素C；α2-巨球蛋白；α1-抗胰蛋白酶；转甲状腺素蛋白

糖尿病是一组以血糖水平增高为特征的代谢性疾病，长期存在的高血糖导致机体各种组织器官(尤其是眼、肾、心脏、血管和神经等)出现慢性损害、功能障碍，严重影响患者的生存质量。近年来，随着人口老龄化及生活水平的提高，糖尿病发病呈逐渐增长的趋势且趋于年轻化[1]。据WHO估计，全球目前有超过2亿的糖尿病患者，预计到2025年将增至4亿。我国现有糖尿病患者超过4千万，居世界第2位[2]。糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后的第3大非传染性疾病，其已逐渐成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题[3]。糖尿病患者需进行日常血糖含量的监测，目前主要采用指尖血血糖试纸条法，但该方法痛苦且增加感染的风险，因此，获取简单快速且无创伤的检测方法对糖尿病的早期诊断和日常监测具有重要的研究意义。研究[4-5]表明，2型糖尿病(2-DM)患者从血糖升高或糖耐量异常到出现糖尿病的临床症状平均时间可长达7年。因此，2-DM早期进行诊断可显著提高患者的治疗效果和生存质量。唾液的临床诊断价值逐渐被人们认识，在唾液中已经鉴定出多个与糖尿病的发生发展密切相关的蛋白质[6]，同时，唾液标本用于糖尿病的检测简单快速且无创伤。本研究拟探讨唾液中与糖尿病发生发展密切相关的胱抑素C(Cys-C)、α2-巨球蛋白(α2-MG)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT)及转甲状腺素蛋白(TTR)在糖尿病早期诊断中的意义及运用，现报道如下。

1资料与方法

1.1临床资料

根据WHO糖尿病专家委员会提出的病因学分型标准(1999)对经过OGTT检查试验的患者进行分类筛选后确定。空腹血糖升高(IFG)患者：5.6 mmol/L<空腹血糖<7.0 mmol/L；糖耐量(IGT)患者：7.8 mmol/L<餐后2 h血糖<11.1 mmol/L；2-DM患者为多次诊断均为空腹血糖达到7.0 mmol/L或任意时刻血糖达到11.1 mmol/L。选取成都医学院第一附属医院2015年6-10月住院糖尿病患者86例(2-DM组)，IFG患者23例(IFG组)，IGT患者31例(IGT组)及体检正常人群38例(正常组)，均排除各种急慢性肾病、肝病及自身免疫性疾病等。正常组：男16例，女22例，年龄(54.0±3.0)岁；IFG组：男10例，女13例,年龄(51.0±4.0)岁；IGT组：男14例，女17例，年龄(55.0±5.0)岁；2-DM组： 男40例，女46例，年龄(50.0±2.0)岁。各组性别、年龄基本相似，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。血糖浓度、肝功能、肾功能及血常规等临床标本指标数据见表1。本研究经成都医学院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2标本的采集与处理

受试者空腹8～10 h后，于次日清晨清水漱口后，头部向前倾斜，采用唾液收集专用管抵住舌头前沿，收集自然分泌的唾液，以唾液量>1.5 mL为宜。将收集到的唾液冰上储存运送回实验室后立即4 ℃ 16 000 g离心10 min，吸取上清液，-20 ℃冰箱中冻存备用。同时，使用真空肝素锂采血管采集受试者外周血4 mL，混匀后室温静置30 min后，3 000 g离心5 min，收集上层血浆，-20 ℃保存备用。

1.3Western Blotting检测唾液中差异性蛋白

通过Western Blotting检测唾液中Cys-C、α2-MG、 A1AT及TTR蛋白的表达水平，amylase作为唾液的内参蛋白进行检测。对收集备用的唾液上清液进行冰上复融后，于4 ℃ 16 000 g离心10 min后，采用BCA法进行总蛋白质定量，调整蛋白浓度至4 μg/uL，再通过Western Blotting进行唾液蛋白含量检测。蛋白定量后，加入一定量的5×上样buffer，100 ℃煮沸5 min，使蛋白充分变性；根据待检测蛋白质的大小选择合适浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Cys-C及TTR选择浓度为15%的分离胶；α2-MG及A1AT选择浓度为12%的分离胶)，每个加样孔中上样40 μg蛋白，电泳2 h左右，待测蛋白分离开后，开始转膜；电泳后将凝胶取出，浸泡于转膜缓冲液中，滤纸浸泡于转膜缓冲液中，PVDF膜在100%甲醇中浸泡30～60 s；自电极板阴极到阳极方向，按照三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸的顺序放置好转膜装置。去除各层之间的气泡，100 V，转膜时间根据具体的蛋白分子大小确定( Cys-C及TTR转膜30 min；A1AT转膜1 h；α2-MG转膜2 h)。转膜结束后，将PVDF膜置入封闭液(5%脱脂奶粉)，室温下振摇封闭2 h。然后加入相应一抗(Cys-C：12245-1-AP；α2-MG：13545-1-AP；A1AT：16382-1-AP及TTR：11891-1-AP)(购自武汉三鹰)，4 ℃孵育14～16 h；取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，15 min/次。 加入HRP标记二抗，37 ℃振摇1 h；用TBST洗涤3次，15 min/次，滴加发光底物，暗室曝光。

胶片经扫描后，Image J2x软件用于Western Blotting条带的半定量分析。统计分析使用GraphPad 5.0软件完成。

1.4ELISA法检测唾液中差异性蛋白

用50 mmol/L的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解蛋白标准品(Cys-C：BC013083；α2-MG：BC040071；A1AT：BC015642及TTR：BC020791)(购自武汉三鹰)及患者唾液标本，加100 μL/孔到96孔酶标板，4 ℃放置14～16 h。第2天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150 μL 1% BSA 37 ℃封闭1 h。 PBST洗涤3次后，每孔加入100 μL相应的抗体(1∶5 000稀释)(Cys-C：12245-1-AP；α2-MG：13545-1-AP；A1AT：16382-1-AP及TTR：11891-1-AP)(购自武汉三鹰)，37 ℃孵育2 h。PBST洗涤5次后，加入100 μL稀释后的HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405 nm吸收值。 用不同浓度标准品及其相应吸光度制作标准曲线，进行唾液蛋白含量的检测。

1.5统计学方法

2结果

2.1唾液中差异性蛋白Cys-C及α2-MG与糖尿病早期病变的相关性

通过对糖尿病患者及早期病变人群的唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR进行Western Blotting检测发现，唾液中Cys-C及α2-MG随着病情的加剧，其表达量明显上调，A1AT轻微上调。TTR无明显改变(图1A)。通过对Western Blotting条带的半定量分析发现，随着病情的加剧，α2-MG(P<0.001)、Cys-C(P<0.001)和A1AT(P=0.018)明显上调，差异有统计学意义；而TTR无明显改变，差异无统计学意义(P=0.072)(图1B)。

图1唾液中差异性蛋白Western Blotting检测及半定量分析比较

注：A：正常组、IFG组、IGT组及2-DM组唾液中，Cys-C、α2-MG、 A1AT及TTR的表达情况；B：对图1A中Western Blotting条带运用Image J2x软件进行半定量分析

2.2唾液标本与相应血液标本中Cys-C及α2-MG的相关性

通过对糖尿病患者及早期病变人群的唾液及血液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR水平的检测发现，唾液中Cys-C、α2-MG及A1AT的含量均随着糖尿病病程明显增加，差异有统计学意义(P<0.001，P=0.003，P=0.021)，而TTR在糖尿病病程中无明显变化，差异无统计学意义(P=0.063)，且唾液中Cys-C、α2-MG、A1AT及TTR均与血液中相应蛋白的表达呈相关性(Cys-C：rs=1.000，P=0.038；α2-MG：rs=1.000，P=0.025；A1AT：rs=1.000，P=0.033；TTR：rs=1.000，P=0.045)，但其水平明显低于血液中的含量(图2～3)。同时，唾液中Cys-C、α2-MG均与患者血液中血糖浓度呈正相关(Cys-C：rs=1.000，P=0.034；α2-MG：rs=1.000，P=0.043)(图4)。

图24组唾液中差异性蛋白的ELISA定量检测比较

图34组血液中差异性蛋白的ELISA定量检测比较

图44组唾液中Cys-C、α2-MG与血液中血糖浓度的相关性比较

注：血糖浓度单位为mmol/L，Cys-C、α2-MG浓度单位为mg/L

2.3唾液差异性蛋白Cys-C及α2-MG用于糖尿病早期诊断效果的评价

唾液中Cys-C检测糖尿病早期IFG及IGT的曲线下面积为0.925，P=0.029；α2-MG相应的曲线下面积为0.960，P=0.021；A1AT曲线下面积为0.674，P=0.056；TTR曲线下面积为0.600，P=0.061(图5)。表明Cys-C及α2-MG可用作糖尿病的早期检测，而A1AT及TTR的诊断意义不佳。

图5唾液中差异性蛋白用于检测糖尿病早期IFG及IGT的ROC曲线比较

3讨论

目前，2-DM的发病机制在蛋白质翻译、翻译后修饰、靶细胞中的信号传递及代谢途径调节等遗传和基因组学方面已有充足的研究。基因组学、蛋白质组学等系统生物学应用于糖尿病的研究中，使糖尿病相关生物标志物的研究飞速发展[7-8]，而对于易于取得的唾液中蛋白质组学的研究也取得良好的结果[9]。基于唾液标本的糖尿病检测可显著减轻糖尿病患者的物理性创伤，适用于其早期诊断和长期疗效监测。

Cys-C是半胱氨酸抑制剂蛋白质中的一种，无组织特异性，不受年龄、性别、体质量和炎症等外来因素的影响，能在所有有核细胞内以恒定速度持续表达[10]。糖尿病常伴随慢性肾损伤，Cys-C可作为肾性糖尿病的早期诊断标志。大量研究表明血清中Cys-C可作为糖尿病发生及病情监控的分子指标，具有良好的临床运用价值[11- 12]。本研究发现唾液中Cys-C的含量与血清中Cys-C含量呈正相关，且在2-DM早期糖耐量受损中明显升高，可作为2-DM发生的早期诊断标志物。

α2-MG是相对分子质量最大的蛋白质，能与蛋白水解酶结合而影响酶的活性，进而选择性保护某些蛋白酶活性[13]。已有研究[14- 15]表明，血清中α2-MG、A1AT与糖尿病发生过程密切相关，可作为糖尿病诊断的生物标志物。本研究发现，唾液中α2-MG、A1AT的含量均与血清中α2-MG、A1AT的含量及血糖浓度呈相关性，ROC曲线表明唾液中A1AT的诊断特异性与灵敏度不佳，故而，α2-MG可作为有效的2-DM生物标志物。

本研究发现，TTR在2-DM早期糖耐量受损过程中，唾液及血液中含量较之正常组均无明显变化[16]。已有研究[17]表明，TTR可作为2-DM心血管疾病发生的诊断指标。在1-DM中，血清中TTR较之正常人群也有明显的升高。表明TTR可能在1-DM或2-DM后期导致的心血管疾病发病风险分析中具有一定的诊断价值。

综上所述，本研究通过对唾液及血液中Cys-C、α2-MG、A1AT和TTR蛋白的检测，表明上述蛋白在患者唾液标本与血液标本中均呈正相关，且唾液中Cys-C及α2-MG可作为糖尿病发病早期的有效诊断标志物。同时，本研究所采用的唾液检测方法，可无创、安全的对患者进行多次检测，该方法有望成为糖尿病早期检测及日常疗效动态监测的新趋势。

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Clinical Study on Different Proteins in Saliva for Early Diagnosis of Type 2 Diabetes

XuYing,ShiJiao,WuDongming,ZhouXiaoping.

DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

【Key words】Type 2 diabetes; Saliva; Cystatin C; alpha-2 macroglobulin; Alpha-1 antitrypsin; Transthyretin

【Abstract】ObjectiveTo study the clinical significance and application of Cys C, α2-MG, A1AT and TTR in saliva for early diagnosis of type 2 diabetes. MethodsThe protein expressions of Cys C, α2-MG, A1AT and TTR in the saliva of 38 normal cases, 23 patients with IFG, 31 patients with IGT and 96 patients with type 2 diabetes were tested by Western-blotting analysis and the proteins were semi-quantitatively analyzed. At the same time, CysC, α2-MG, A1AT and TTR in saliva and serum were detected by ELISA for quantitative analysis and further correlation study. ROC curves of Cys C, α2-MG, A1AT and TTR were drawn according to the quantitative results of ELISA and the specificity and sensitivity of each detection were determined. ResultsThere were significant increase in Cys C, α2-MG and A1AT, but no significant changes in TTR protein in saliva of patients with type 2 diabetes according to the results of Western-blotting test and ELISA detection. Cys-C,α2-MG, A1AT and TTR in saliva and serum were positively correlated with each other, and Cys-C and α2-MG in saliva were positively correlated with blood glucose concentration. ROC curves showed that Cys C and α2-MG in saliva could be used as early diagnostic markers of type 2 diabetes. ConclusionThe detection of Cys C and α2-MG in saliva has potential clinical significance in the early screening of Type 2 diabetes and clinical value in preventing and treating diabetes in the early stage.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.003

*基金项目：四川省卫生和计划生育委员会科研课题(No:140019)；四川省2014年学术和技术带头人培养资金资助

【中图分类号】R587.1

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160607.1058.002.html

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