紫芪方对失血性休克大鼠肠道通透性的影响

史成和，吴成林，张达矜，安怀杰，李玉军



紫芪方对失血性休克大鼠肠道通透性的影响

史成和，吴成林，张达矜，安怀杰，李玉军

［摘要］目的 观察紫芪方对失血性休克Wistar大鼠肠道通透性的影响。方法 实验采用Wistar大鼠，按照改良Wigger’s法复制失血性休克模型，然后将模型大鼠随机分为正常对照组、失血性休克组、紫芪方组、参附组及蒸馏水组（各组n=6）。除正常对照组和休克组，其他组在给予2倍失血量液体复苏后分别灌胃给予不同干预药物，观察肠道黏膜组织结构变化，并测定血浆内毒素含量、肠道细菌移位情况、血浆D-乳酸含量和血浆二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）含量。结果 紫芪方组肠黏膜损伤程度明显轻于失血性休克组。紫芪方组血浆内毒素含量、血浆细菌移位菌落数、肝脏细菌移位菌落数和血浆D-乳酸分别为（177.0±45.0）EU/ L、（29±8）CFU、（31±16）CFU、（0.39±0.04）mmol/ L，较失血性休克组显著降低（P＜0.01）。紫芪方组血浆DAO含量为（0.40±0.06）kU/ L，较失血性休克组降低（P＜0.05），且紫芪方在降低血浆细菌移位菌落数、肝脏细菌移位菌落数和血浆DAO 3个方面的效应强于阳性对照药物参附（P＜0.05）。结论 紫芪方对失血性休克大鼠肠道通透性有保护作用，为紫芪方保护肠道屏障功能的有效性提供了重要依据。

［关键词］紫芪方；失血性休克；肠道通透性

［作者单位］100048北京，海军总医院中心实验科（史成和，吴成林，张达矜，安怀杰）；100841北京，海军司令部直属卫生处（李玉军）

失血性休克是大量失血后引起有效循环血量骤减、组织灌注严重不足、细胞代谢出现紊乱以及功能受到损伤的过程［1］。在平时和战时，失血性休克都是导致创伤伤员死亡的重要原因之一。文献报道，有32.6%～59.5%的伤员在战时死于失血性休克［2］。休克时，全身多个内脏器官会发生损伤，其中肠道组织能量代谢变化最早、恢复最迟，使其成为休克的重要靶器官［3］；另一方面，肠道是体内最大的“储菌所”和“内毒素库”，其功能一旦受损，通透性就会增加，细菌和内毒素就会发生移位，进而介导释放多种炎症介质，导致肠道及其他内脏器官功能损伤的加重。因此，在失血性休克的过程中，肠道既可以作为损伤的“靶”器官，又可成为损伤的“激发”器官，保护肠道功能对于减少失血性休克损伤具有重要意义。

目前失血性休克的早期治疗主要是及早大量补液扩充血容量，并在合适时机使用一些微循环保护药物配合治疗［4］。近年来，借助现代提炼技术制成的中药制剂逐渐用于临床，如具有活血化瘀、疏通经络功能的参附注射液，可通过增加小肠黏膜固有层IgA的含量，降低黏膜细胞凋亡指数、血浆内毒素及炎性因子含量，保护肠道黏膜屏障功能，从而达到抗失血性休克的作用［5-7］。紫芪方由人参、白芨、大黄等组成，具有扶正固脱、通瘀开闭、清热解毒等作用。前期研究表明，紫芪方可通过减少细胞凋亡和乳酸脱氢酶漏出量及保护细胞线粒体膜电位对肠上皮细胞系ICE-6细胞缺氧复氧损伤起保护作用［8-10］。本实验拟通过观察肠道黏膜组织结构变化并测定Wistar大鼠血浆内毒素含量、肠道细菌移位情况、血浆D-乳酸含量和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）含量，观察紫芪方对失血性休克模型大鼠肠道通透性的保护作用。

1　材料与方法

1.1实验动物与主要试剂 健康成年Wistar雄性大鼠30只，清洁级，体质量（230±20）g，由第三军医大学野战外科研究所动物室提供［SCXK-（渝）-2002-003，标准二级动物房］。黄芪、大黄、人参、附子、丹参、白芨（重庆中药研究所秦松云教授进行鉴定）。紫芪方（人参、附子、黄芪、丹参、大黄、白芨各配伍比例为1∶1∶1∶1∶1∶1），阳性对照药物——参附（人参、附子配伍比例为2∶1）。按量称取不同组分药物，清水浸泡1 h，煎煮3次（30、15、15 min），合并煎液浓缩，当相对密度达到1. 2左右时，加入95%乙醇至药液含醇量为70%，静置过夜，采用水浴蒸发的方法至药液无乙醇味后加入蒸馏水，经过滤收集于密闭容器内（生药/水为0.5 g/ mL）。D-乳酸标准液、D-乳酸脱氢酶、邻茴香胺甲醇溶液、尸胺二氢氯化物、辣根过氧化物酶和DAO标准液均购自Sigma公司，内毒素检测鲎试剂购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验方法

1.2.1动物分组和失血性休克模型制备 30只Wistar大鼠常规饲养7 d后采用随机数字表法随机分为正常对照组、失血性休克组、失血性休克2倍平衡盐水复苏加紫芪方治疗组（紫芪方组）、失血性休克2倍平衡盐水复苏加参附治疗组（参附组）、失血性休克2倍平衡盐水复苏加蒸馏水治疗对照组（蒸馏水组），每组6只。失血性休克采用改良Wigger’s模型［11］，实验前1 d天动物禁食过夜，自由饮水。实验当天动物按50 mg/ kg腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉，右股动脉插管，全身肝素化（肝素500 U/ kg），连接三通装置，然后分别进行注射器和血压计的连接，供股动脉放血和血压测定用。动物放血约10 min，待血压降到40 mmHg，将该血压维持2 h。

1.2.2给药方法 参照文献［12］使用的药物剂量，为正常人体使用剂量的5倍以上。紫芪方组、参附组和蒸馏水组于血压保持40 mmHg 2 h后，静脉首先给予2倍失血量的平衡盐液，然后采用灌胃的给药方式分别给予4.5 mL紫芪方、4.5 mL参附和4. 5 mL蒸馏水。取5 mL的注射器，对上述药液进行抽取并连接针头。固定大鼠于左手，保持头颈平直，装有药液的注射器持于右手，将针头沿口角左侧，经口腔徐缓插入胃中，并注入药液。于治疗5 h后活杀动物，收集血浆、肠组织样本。

1.3检测指标和方法

1.3.1肠黏膜组织苏木素-伊红染色 迅速取部分回肠（距回盲部5 cm），于预冷的生理盐水中轻洗2次、去除残留肠内容物。切取部分组织块（1. 0 cm× 0. 5 cm），浸入10%中性缓冲甲醛液中固定（20倍苏木素-伊红于样本大小的量），30 min以上。石蜡包埋切片，厚度4 μm，常规苏木素-伊红染色后光镜下观察肠黏膜组织结构。

1.3.2血浆检测指标 血浆内毒素定量测定采用鲎试剂基质偶氮显色法；血浆D-乳酸和DAO测定用分光光度法。

1.3.3细菌移位 动物脏器细菌定量培养，按照前述实验分组，无菌采集血浆及活杀大鼠后剪取肝脏及肠系膜淋巴结，称肝脏及肠系膜淋巴结后置于玻璃匀浆器中进行匀浆，低温离心（3 000 r/ min，15 min），取100 μL上清液接种于血培养皿进行培养，置于37℃孵箱中孵育24 h后计数。

1.4统计学处理 应用SPSS 17. 0软件，计量资料用均数±标准差（±s）进行表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠肠道黏膜组织结构变化 苏木素-伊红染色后观察正常对照组大鼠肠黏膜组织发现其结构完整，排列整齐，肠上皮细胞紧密连接，形成完整的机械屏障；失血性休克组肠黏膜出现固有层水肿，中央乳糜管扩张，黏膜上皮下间隙形成，肠上皮细胞大量脱落，固有层淋巴细胞增多。紫芪方治疗后肠黏膜可见少数中性粒细胞浸润，中央乳糜管轻度扩张，但肠黏膜上皮比较完整，少量肠上皮细胞脱落（图1）。

图1　大鼠肠道黏膜组织结构变化（苏木素-伊红染色，×200）

2.2大鼠颈动脉血浆内毒素含量 正常对照组血浆内毒素含量为（41.3±14.3）EU/ L。失血性休克后大鼠颈动脉血浆内毒素含量显著升高，为（295.3± 34.3）EU/ L，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。经紫芪方、参附治疗后血浆内毒素水平均明显降低，分别为（177.0±45.0）、（194.3±51.5）EU/ L，2组比较差异无统计学意义（P＞0.05），与失血性休克组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。蒸馏水组血浆内毒素水平为（246.0±33.4）EU/ L，与紫芪方组和参附组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3大鼠细菌移位 正常对照组的血浆样本和脏器匀浆样本经细菌定量培养后，未观察到明显的菌落形成。失血性休克组和蒸馏水组的血浆、肝脏及肠黏膜淋巴结样本经培养后均可见大量菌落出现。与失血性休克组比较，紫芪方组（P＜0.01）和参附组（P＜0.05）菌落数均显著降低；且紫芪方组较参附组效果更好（P＜0.05），血浆样本仅为参附组的32%，肝脏样本为参附组的45%。肠系膜淋巴结样本结果没有显示出规律性的变化（表1）。

表1　大鼠不同脏器细菌移位的菌落数（±s，CFU，各组n=6）

表1　大鼠不同脏器细菌移位的菌落数（±s，CFU，各组n=6）

注：与失血性休克组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与蒸馏水组比较，△P＜0.05，▲P＜0.01；与参附组比较，#P＜0.05

组别　　血浆　　肝脏　　肠系膜淋巴结正常对照组　0　0　0失血性休克组　120±32　100±29　8±4紫芪方组　29±8**▲#　31±16**▲#　0参附组　91±16*△　69±10*△　0蒸馏水组　135±12　106±21　0

2.4大鼠血浆D-乳酸含量 正常对照组血浆D-乳酸含量为（0.26±0.02）mmol/ L。失血性休克组大鼠血浆D-乳酸含量与正常对照组大鼠相比，明显升高［（0.58±0.06）mmol/ L］，差异有统计学意义（P＜0.01）。紫芪方组、参附组和蒸馏水组血浆D-乳酸含量分别为（0.39±0.04）、（0.37±0.05）、（0.55± 0.04）mmol/ L；与失血性休克组和蒸馏水组相比，紫芪方组和参附组血浆D-乳酸含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；但紫芪方组和参附组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5大鼠血浆DAO含量 正常对照组血浆DAO含量为（0.1±0.03）kU/ L。与正常对照组相比，失血性休克组血浆DAO含量显著升高［（0.69±0.19）kU/ L］，差异有统计学意义（P＜0.01）。紫芪方组、参附组和蒸馏水组血浆DAO含量分别为（0.40±0.06）、（0.49±0.10）、（0.57±0.08）kU/ L；与失血性休克组和蒸馏水组相比，经紫芪方、参附治疗后血浆DAO含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；且紫芪方组低于参附组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

肠道通透性是指分子通过非载体依赖扩散方式通过肠道上皮细胞层的特性，与肠屏障功能密切相关［13］。肠屏障可以分为机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障4个层次，在正常情况下肠黏膜可以维持一定的通透性、吸收营养物质和抵御外界致病性抗原的入侵［14］。由于小肠绒毛微血管呈网囊型结构，对体循环血压的改变十分敏感，使得发生休克时肠黏膜极易出现缺血、缺氧性损害［15-16］，导致肠屏障功能受损、黏膜通透性增加。本研究结果证实正常对照组大鼠肠黏膜绒毛排列整齐，上皮细胞结构完整；失血性休克导致的肠道损伤后可见绒毛破损，上皮细胞变性、脱落病理学改变；紫芪方治疗后大鼠肠绒毛结构基本完整。从形态学角度上看，紫芪方对肠上皮细胞具有明显的保护作用。

内毒素的主要化学成分是革兰阴性菌细胞壁外部的脂多糖，可分为类脂A、核心多糖和特异多糖3部分。当肠屏障受到破坏时，肠道内毒素可移位进入血液循环，引起内毒素血症［17］。本研究发现失血性休克大鼠血浆内毒素含量显著升高，而经紫芪方和参附治疗后，大鼠血浆内毒素的含量明显降低，说明紫芪方和参附能够增强肠道的选择通透性功能。

正常情况下，肠道内寄居着大量的正常菌群，但是当肠屏障功能受损后，肠道内的细菌会穿过肠道黏膜进入正常无菌的组织，如肠系膜淋巴结、肝、脾、血液及更远处器官，这个过程被称为细菌移位［18］。本研究对不同处理条件的实验动物的血浆、肝脏和肠系膜淋巴结匀浆液进行细菌定量培养，与正常对照组显示的无培养菌落出现相比，失血性休克大鼠的上述样本经过血平皿培养，呈现大量菌落；提示肠黏膜上皮细胞受损严重，肠道通透性增加，进而导致肠道细菌进入循环系统和其他脏器，发生细菌移位。经紫芪方和参附治疗后，细菌菌落明显减少；提示紫芪方和参附可以保护肠黏膜上皮细胞，维持肠道正常的通透性，减少细菌移位，且紫芪方效果强于参附。

D-乳酸是胃肠道内的固有细菌的代谢终产物，而哺乳动物自身既不会产生，也缺乏代谢D-乳酸的酶类，因此当各种因素导致肠道通透性增加时，D-乳酸即可进入血液循环引起血浆D-乳酸含量的升高［19-20］。DAO是主要存在于人类和哺乳动物的小肠黏膜上层的绒毛上皮细胞胞浆中的细胞内酶，除少量分布于子宫内膜绒毛中，其他组织或细胞中基本没有DAO分布。正常条件下血浆DAO含量很低，因此DAO能较准确地反映小肠黏膜的结构功能。当肠黏膜上皮细胞受到损伤，肠屏障结构受到破坏时，肠黏膜绒毛上皮细胞会释放大量的DAO入血，使血中DAO含量迅速升高。通过测定血浆DAO含量，尤其在无创情况下测定能更直接地反映肠上皮细胞及肠屏障结构的损伤和修复情况［21-22］。本研究发现，失血性休克导致的肠缺血、缺氧或再灌注损伤后D-乳酸和DAO含量显著升高，表明肠黏膜上皮细胞大量受损，肠道通透性增加，D-乳酸和DAO进入血液循环引起血中D-乳酸和DAO水平的升高；经过紫芪方治疗后，可抑制D-乳酸和DAO的升高，表明紫芪方具有保护肠黏膜上皮细胞的作用，进而维持正常的肠道通透性和屏障功能。

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Effect of Ziqi compound on the intestinal permeability of rats with hemorrhagic shock

SHI Chenghe1，WU Chenglin1，ZHANG Dajin1，AN Huaijie1，LI Yujun2
（1. Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2. Department of Health of Navy Command，Beijing 100841，China）

［Abstract］Objective To observe the influence of Chinese herb medicine（Ziqi）on the intestinal permeability of male Wistar rats with hemorrhagic shock. Methods Hemorrhagic shock model was produced by modified Wigger’s model. Male Wistar rats were divided into five groups randomly（the normal group，the hemorrhagic shock group，the resuscitation and Ziqi compound treatment group，the resuscitation and Shenfu treatment group，the resuscitation and distilled water treatment control group，n = 6）. Except for the normal and hemorrhagic shock group，different drugs were given by gastric perfusion after resuscitation with double blood loss of liquid. The structure changes of intestinal mucosa and content of endotoxin in plasma，numbers of translocation of bacteria，content of D-lactic acid and diamine oxidase（DAO）in plasma were evaluated. Results The degree of intestinal injury in Ziqi group was significantly less serious than that in hemorrhagic shock group. Levels of endotoxin in plasma（177. 0±45. 0）EU/ L，numbers of bacteria from plasma（29± 8）CFU and liver tissues（31±16）CFU，and levels of D-lactic acid in plasma（0. 39±0. 04）mmol/ L in Ziqi compound group decreased markedly as compared with those in hemorrhagic shock group（P＜0. 01）. Levels of DAO in plasma（0. 40±0. 06）kU/ L in Ziqi compound group decreased as compared with those in hemorrhagic shock group（P＜0. 05）. The effect of Ziqi compound in decreasing numbers of bacteria from plasma and liver tissues，and levels of DAO in plasma was stronger than the effect of the positive control drug Shen-Fu compound（P＜0. 05）. Conclusion Ziqi compound has significant protective effect on maintaining intestinal permeability，which provides an important basis for the protection of the intestinal barrier function by Ziqi compound.

［Key words］Ziqi compound；Hemorrhagic shock；Intestinal permeability

［中图分类号］R285

［文献标志码］A

［文章编号］2095-3097（2016）02-0087-05

doi：10. 3969/ j. issn. 2095-3097. 2016. 02. 006

［基金项目］军队后勤科研计划重点项目（BHJ14C009）

收稿日期：（2015-06-15 本文编辑：张在文）