姜黄素对HIV-1 gp120多肽诱导的大鼠神经元HSP70 mRNA表达的影响*

巫金娜黄莉文



姜黄素对HIV-1 gp120多肽诱导的大鼠神经元HSP70 mRNA表达的影响*

巫金娜①黄莉文①

【摘要】目的：初步阐明姜黄素对HIV-1 gp120多肽诱导的大鼠神经元HSP70 mRNA表达的影响。方法：采用流式细胞术检测HIV-1 gp120多肽诱导大鼠神经元凋亡情况；采用实时定量PCR（Realtime PCR）检测热休克蛋白70（HSP70）的表达情况，分析姜黄素对大鼠神经元HSP70 mRNA的影响。结果：HIV-1 gp120多肽可诱导大鼠神经元凋亡。姜黄素可缓解HIV-1 gp120 V3区多肽诱导神经元凋亡。HIV-1 gp120多肽可降低大鼠大脑皮质神经元HSP70 mRNA的表达。姜黄素能提高大鼠皮质神经元HSP70 mRNA表达，减轻HIV-1 gp120多肽诱导的神经元凋亡。结论：姜黄素可调节HSP70 mRNA表达，减轻HIV-1 gp120多肽诱导神经元凋亡。

【关键词】姜黄素； 人类免疫缺陷病毒1型； 糖蛋白120； 热休克蛋白70； 细胞凋亡

①广州医科大学附属口腔医院 广东 广州 510140

20世纪80年代，首例获得性免疫缺陷综合症（AIDS）病例被报道。AIDS由人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）所致，病毒可通过其包膜糖蛋白gp120，引发中枢神经系统细胞功能障碍［1-2］，进而导致神经退行性病变或神经认知障碍。但HIV-1导致中枢神经系统损伤的具体机制仍不清楚。虽然高效抗逆转录病毒疗法（HAART）有效地降低了艾滋病患者的死亡率和全身性机会性感染的发生率，但由于血脑屏障的存在，抗病毒药物很难进入中枢神经系统。因此迫切需要开发新的抗HIV-1脑病的药物。热休克蛋白70（HSP70）是一个分子量为70kDa的热休克蛋白应激诱导分子，研究发现，HSP70对神经变性疾病具有神经保护功能［4］。姜黄素是从草本植物姜黄根茎中提取的疏水多酚，能改善HIV-1 gp120引起的记忆障碍［5］。在本研究中，我们旨在阐明姜黄素对HIV-1 gp120多肽诱导的大鼠神经元HSP70 mRNA表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠30只用于取大鼠大脑皮质神经元［License No.SCXK（yue）（2006-0015）］购自广东省医学实验动物中心。其中正常组5只、对照组5只、模型组5只、0.5 μg/mL多肽组5只、1 μg/mL多肽组5只、0.5 μg/mL姜黄素处理组5只、1 μg/mL姜黄素处理组5只，所有动物实验进行协议均通过本院伦理委员会批准。

1.2细胞培养方法 原代大鼠皮质神经元均参照早前的报道研究［6］，并做了轻微的调整。具体为：处死大鼠，将新鲜皮质组织分为约1 mm的切片，放置在15 mL离心管（D-Hanks 溶液与0.25%胰蛋白酶体积比为2∶1）中，37 ℃消化10 min，离心5 min，悬浮沉淀，过筛，将神经元接种在6孔培养板（含聚-L-赖氨酸）上，37 ℃，5% CO2培养4 h，更换含2% B27的neurobasal培养基（Life Technologies-Gibco，Grand Island，NY，USA）培养，以确保神经元构成大于95%。

1.3多肽序列及合成 多肽序列：Asn-Asn-Thr-Arg-Lys-Ser-Ile-Arg-Ile-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-Ile-Gly-Lys-Ile-Gly（分子式：C114H199N41O31；分子量：2，640.06），由上海生工合成。

1.4细胞凋亡分析 采用FITC标记的膜联蛋白V 和PI法分析细胞凋亡情况。HIV-1 gp120 V3区多肽成功诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡后，将大鼠大脑皮质神经元与终浓度为0.5 μg/mL及1 μg/mL的姜黄素分别共同孵育。首先将大鼠皮质神经元接种在6孔板，5 d后加入HIV-1 gp120多肽（0.5μg/mL、1μg/mL）处理48 h，用预冷PBS洗涤细胞，用1X结合缓冲液悬浮细胞。将悬浮液转移到含有FITC膜联蛋白V和PI的培养管中，轻轻涡旋并孵育15 min；加入1X结合缓冲液。利用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。随后，分别沉默及过表达大鼠大脑皮质神经元HSP70基因，观察姜黄素对HIV-1 gp120多肽所致大鼠大脑皮质神经元凋亡率的影响。

1.5构建腺病毒载体 按照以往方法进行［7］。利用Adeasy系统，将HSP70连接到pShuttle载体上，用T4连接酶连接；感受态细胞转化，涂平板（卡拉霉素），37 ℃过夜。挑取30个克隆，提取DNA并用PacI筛选，琼脂糖电泳（0.8%），并测序鉴定。

1.6实时定量PCR 提取细胞RNA，并逆转录至cDNA。所有试剂均自ABI（Applied Biosystems）。所得产物保存于4 ℃。利用使用说明书优化Realtime PCR反应条件。采用ABI 7500 Real-time PCR仪进行反应。数值由2Ct（calibrator）-Ct （test）计算得出。利用Real-time PCR检测gp120多肽处理的大鼠皮层神经元中HSP70 mRNA的表达情况，分析姜黄素对大鼠皮层神经元HSP70的影响。

1.7统计学处理 采用PEMS 3.1统计学软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验或方差分析，计数资料以百分比表示，比较采用 X2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1HIV-1 gp120多肽对大鼠皮层神经元的作用 采用流式细胞术检测HIV-1 gp120多肽所致的神经元凋亡率可发现，经（0.5 μg/mL及1 μg/mL）多肽处理后，神经元凋亡比例为17.4%（图1），HIV-1 gp120多肽可诱导大鼠皮层神经元凋亡。

图1　HIV-1 gp120多肽诱导大鼠皮层神经元凋亡

2.2HIV-1 gp120多肽对大鼠大脑皮质神经元HSP70 mRNA表达的影响 采用Real-time PCR检测HIV-1 gp120多肽处理的大鼠皮层神经元中HSP70 mRNA的表达情况发现，与对照组相比，0.5 μg/mL多肽组的HSP70 mRNA表达水平为（0.56±0.06），而1 μg/mL多肽组HSP70 mRNA表达水平为（0.38±0.03），多肽处理可下调大鼠大脑皮质神经元HSP70 mRNA表达。

2.3姜黄素对大鼠皮质神经元HSP70 mRNA表达的影响 采用Real-time PCR分析姜黄素对大鼠皮层神经元HSP70 mRNA的影响发现，与对照组相比，大鼠皮质神经元经不同浓度的姜黄素（0.5 μg/mL及1 μg/mL）处理后，HSP70 mRNA表达显著提高，分别为（1.59±0.16）、（2.38±0.23），姜黄素可以增加HSP70 mRNA表达。

2.4姜黄素对HIV-1 gp120多肽诱导的大鼠皮层神经元的影响 与模型组相比，0.5 μg/mL姜黄素处理组HSP70 mRNA的表达为（1.18±0.13），1 μg/mL 姜黄素处理组HSP70 mRNA的表达为（1.22±0.15）；姜黄素可以增加大鼠大脑皮质神经元中HSP70 mRNA的表达。与HIV-1 gp120多肽处理组对比，沉默HSP70基因后，0.5 μg/mL姜黄素处理组cleaved caspase-3 mRNA表达为（1.16±0.15），1 μg/mL姜黄素处理组表达为（1.23±0.13）；姜黄素处理组中凋亡特异性蛋白cleaved caspase-3 mRNA表达更高。

3　讨论

研究表明，HIV-1可致神经系统功能障碍，其重要特征是神经元凋亡［8］。HIV-1包膜糖蛋白HIV-1 gp120能够在小鼠体内诱导出类似HIV-1相关性痴呆患者的神经病理变化［9］。此外，HIV-1 gp120可通过caspase-3途径，产生神经毒性［10］。HSP70是分子量为70kDa的具有较高的神经保护能力热休克蛋白［11］。研究结果表明，在神经退行性疾病帕金森综合症中，HSP70可作为分子伴侣产生神经保护作用［12］。并且，HSP70能调节Apaf-1和AIF信号通路，减轻并抑制原代皮质神经元和SH-SY5Y细胞凋亡［13］。姜黄素是从姜科、天南星科的植物根茎中提取的一种能够穿过血脑屏障化学物质［14］。以往的研究发现，姜黄素与HIV-1核苷酸序列的长末端重复序列（LTR）结合，抑制后者活性。姜黄素还可抑制HIV-1复制所需的蛋白酶、整合酶以及与HAD相关的一些细胞因子（TNF-α，IL-1β等）以及一氧化氮、自由基等［15］。

本研究表明，HIV-1 gp120多肽可降低HSP70 mRNA表达。姜黄素可调节HSP70 mRNA表达，降低HIV-1 gp120多肽所致的大鼠大脑皮质神经元凋亡。这些结果表明，姜黄素可通过调节HSP70 mRNA表达情况，降低大脑皮质神经元凋亡率。这使姜黄素有望开发成为新的治疗HIV相关性痴呆的药物。但由于HIV-1相关性脑病的复杂性，姜黄素对HIV-1相关性脑病的干预作用仍需进行大规模的实验来证实。

参考文献

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doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.008

*基金项目：广东省医学科学技术研究基金项目（A2015335）

通信作者：巫金娜

收稿日期：（2015-12-08） （本文编辑：蔡元元）