CoxA16感染不同病情手足口病患者NK细胞表达变化及临床意义*

李莉



CoxA16感染不同病情手足口病患者NK细胞表达变化及临床意义*

李莉①

【摘要】目的：分析探讨NK细胞在CoxA16感染的不同病情手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）患者中的表达差异及临床意义。方法：收集2015年4-8月本院感染科确诊的CoxA16感染HFMD病例外周血标本54例，按临床表现分为普通型组（16例）、重型组（18例）和危重型组（20例）；同时，收集EV71感染重型HFMD病例18例作为对照组。患者年龄均为15～24个月。采用流式细胞术对上述外周血标本中NK细胞进行检测。结果：与正常健康儿童NK细胞参考值比较，普通型患者中NK细胞在淋巴细胞亚群中的相对百分比明显增高，而在重症病例中，重型患者NK细胞相对百分比降低，危重型病例NK细胞却显著升高。普通型组与重症组（包括重型组及危重型组）及重型组与危重型组组间NK细胞百分比比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。此外，EV71感染重症病例中NK细胞百分比高于正常值，与CoxA16感染重症病例的NK细胞低于正常值相反，两组间NK细胞表达差异比较有统计学意义（P＜0.05）。结论：CoxA16感染HFMD患者外周血中NK细胞的表达与其病情进展程度具有很大的相关性；而且在重症HFMD病患者中NK细胞的表达高低还与患者感染的不同病毒类型有关。推测NK细胞在不同病情HFMD中的活化效应不仅受到感染病毒致病性高低的影响，而且在病情危重时，在很大程度上主要受到危重型临床症状的影响。

【关键词】NK细胞； CoxA16； 手足口病； EV71； 临床意义

①昆明市儿童医院 云南 昆明 650228

First-author’s address：Kunming Children’s Hospital，Kunming 650228，China

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是全球性儿童传染疾病，近年来在亚太地区暴发流行呈上升趋势，以2岁左右儿童感染居多［1-3］。引发HFMD的致病病原体主要包括肠道病毒71（Enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒16（CoxA16）两种，其中EV71具有嗜神经毒性，能够引发神经系统并发症，病情危重时会导致患者死亡；目前大量研究集中于对其致病分子机制研究［4-6］。而对于CoxA16，多数报道显示其引发的HFMD病情较轻，重症病例数相对较少，因此，研究相对较少；但自2008年其在芬兰引发HFMD暴发流行以来，目前也被认为是与EV71同样可以导致患者病情发展至危重、甚至死亡的致病病原体［7-8］。

NK细胞，作为人体内抗病毒免疫反应的主要免疫细胞之一，在病毒感染后，不仅能直接释放颗粒酶和穿孔素杀伤和清除已感染的靶细胞，而且还能产生大量炎性因子、免疫调节因子抑制病毒的表达。同时NK细胞还可激活、招募其他效应细胞参与抗病毒免疫应答，诱导感染细胞发生凋亡［9］。文献［10］表明，NK细胞缺乏不仅会增加CMV、VZV、HSV、痘病毒以及流感病毒的易感性，而且会加重疾病的病情。这说明，NK细胞减少或缺失很可能是病毒感染后影响疾病发展恶化的风险因素之一。目前，对于CoxA16感染后，HFMD患者体内的NK细胞功能尚无定论，因此，本研究旨在寻找发现NK细胞在CoxA16感染的不同病情HFMD中的作用及临床意义。

1　资料与方法

1.1一般资料 采集2015年4-8月本院感染科确诊的CoxA16感染手足口病患者外周血标本54例；患者年龄15～24个月；按临床分类分为普通型组16例、重型组18例及危重型组20例。此外，还收集了15～24月年龄段EV71感染重症手足口病病例外周血标本15例作为对照。各组间一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2诊断标准 根据卫生部颁发的《手足口病诊疗指南》（2010年版）及《肠道病毒71型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识》（2011年版）的诊断标准按照临床分类［11-12］，即普通型病例（手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴发热）；重症病例，包括重型（出现神经系统受累表现，如：精神差、嗜睡、易惊醒、谵妄；头痛、呕吐；肢体抖动，肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍；无力或急性迟缓性麻痹；惊厥。体征可见脑膜刺激征，腱反射减弱或消失）以及危重型（出现下列情况之一者：频繁抽搐、昏迷、脑疝或呼吸困难、紫绀、血性泡沫痰、肺部罗音等或休克等循环功能不全表现）收集病例。

1.3试剂及主要仪器 试剂：采用BD公司生产的检测淋巴细胞亚群的试剂盒 BD Multitest 6-color TBNK Reagent。该试剂盒中含有识别富集不同淋巴亚群（T细胞、B细胞以及NK细胞）的抗体，其中包括识别NK细胞的抗体（CD16和CD56 PE）、识别T细胞的抗体（CD3 FITC）、为淋巴细胞群设置的CD45 PerCP-Cy™5.5、检测CD4+T细胞的CD4 PE-Cy™7、识别B淋巴细胞的CD19 APC以及识别CD8+T细胞的CD8 APC-Cy7。主要检测仪器：BD FACSCanto™，使用BD FACSCanto™软件进行参数设置、质控监测以及数据分析。

1.4方法 流式细胞仪检测：采集患者静脉血2～3 mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作说明书，分别向已编好号的试管中加入20 μL六色单克隆抗体和同型对照；分别向试管中加入混匀的100 μL抗凝血；混匀，避光，室温孵育15～20 min；加入已稀释好的溶血素600 μL混匀避光室温溶血8～10 min；上机检测。

1.5统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，以中位数及5%～95%置信区间表示各组NK细胞的表达情况，比较采用 X2检验；计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1CoxA16感染不同病情HFMD患者外周血NK细胞的表达比较 数据结果显示，普通型HFMD患者外周血淋巴细胞亚群中NK细胞百分比（15.850%）显著高于正常健康儿童NK细胞参考值（8.000%），而在重症病例中，NK细胞在临床分类的重型以及危重型HFMD中表达不一致；重型时为6.535%，低于正常值，而危重型时为22.645%，显著高于正常值。由此提示在普通型病例中，NK细胞可能发挥着重要的抗病毒免疫效应；但在病情发展至重症时，NK细胞发挥的免疫效应很可能因患者重症程度病情不同而表现不同，见表1。

表1　CoxA16感染不同病情HFMD患者外周血NK细胞的表达比较 %

2.2NK细胞表达变化与病情严重程度之间的关系比较 重型组NK细胞表达为（6.394±2.036）%，明显低于普通型组的（16.423±4.438）%和危重型组的（25.284±9.725）%，差异比较均有统计学意义（P＜0.05）；且普通型组明显低于危重型组，差异比较有统计学意义（P＜0.05）。由此说明，15～24个月年龄段、CoxA16感染的HFMD患者外周血中NK细胞的表达变化与患者的不同病情间具有很大的相关性，见图1。

图1　NK细胞表达变化与病情严重程度之间的关系比较

2.3CoxA16感染重型HFMD患者与EV71感染重型HFMD患者外周血中NK细胞表达比较 与正常健康儿童参考值（8.000%）比较，EV71感染的重型HFMD患者外周血NK细胞百分比明显升高升高，与CoxA16感染的重型HFMD患者NK细胞百分比降低的情况相反，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。在重型HFMD患者体内，NK细胞的表达变化与患者感染病毒（CoxA16或EV71感染）类型间具有一定的相关性。即不同病毒感染情况下，NK细胞受病毒刺激活化程度不同，表达差异也相对明显，见图2。

表2　CoxA16感染重型HFMD患者与EV71感染重型HFMD患者外周血中NK细胞表达比较 %

图2　CoxA16感染重型HFMD患者与EV71感染重型HFMD患者外周血中NK细胞表达比较

3　讨论

病毒感染后，NK细胞作为主要免疫细胞之一，同T细胞、B细胞一起在机体内发挥着非常重要的抗病毒免疫作用［13-15］。目前关于NK细胞发育的最新研究同时观察到NK细胞和细胞毒性T细胞（CTL细胞）在反应时相及高峰出现上有显著互补，即NK细胞反应在前，CTL细胞紧随其后。当CTL细胞反应迟钝或缺乏时NK细胞的高峰及持续时间会自动延后。这提示NK细胞对CTL有调节作用，而且NK细胞的发育很可能早于T细胞［16］。基于此，笔者推测，处于成长发育期儿童体内的NK细胞功能也很可能优于T细胞，而且还有一种情况是T细胞功能受抑时，NK细胞发挥的抗病毒免疫反应很可能更强。

对于成长期的儿童，其体内的淋巴细胞亚群与年龄密切相关，有文献报道，年龄处于15～24个月的正常健康儿童，其外周血中NK细胞百分比相对较低（8.000%）。当年龄大于2岁后，NK细胞随年龄增大而逐渐增多，成人时，NK细胞达13.000%。本研究中选取的患者病例年龄均处于15～24个月，在病毒刺激情况下，普通型及危重型患者NK细胞均明显升高，而重型患者NK细胞减低；而且普通型与重型、危重型以及重型与危重型间NK细胞表达比较均有显著差异，一方面说明NK细胞的表达与CoxA16感染的不同HFMD病情有关，另一方面也提示即便同是重症HFMD，重型及危重型患者体内NK细胞的表达也可能会截然相反。这可能与CoxA16感染的重症HFMD患者在不同临床表现时，其体内的免疫功能已经出现紊乱有关。

NK细胞作为机体内的非特异性杀伤细胞，在病毒急性感染初期，可迅速扩增杀死体内已感染病毒细胞，但在持续感染期，其杀伤病毒感染细胞的功能很可能因病毒的干扰而受到抑制［10，17-18］。有研究显示在急性HBV感染早期，NK细胞的杀伤作用增强，而在慢性乙型肝炎、肝硬化患者体内NK细胞数量及活性均受抑制，提示HBV的持续存在很可能与病毒抑制NK细胞为代表的固有免疫系统功能有关［19］。本研究中发现的CoxA16感染早期，普通型HFMD患者NK细胞显著升高；而当病情发展至重型时，机体内NK细胞减低，该结果与上述研究结果相符。对于本研究中发现的危重型病例NK细胞显著升高的原因，可能在于危重型时，患者体内免疫功能的变化在很大程度上受到了患者危重的临床症状的影响，由于致病病毒对于患者中枢神经系统的严重干扰，患者出现抽搐、昏迷、脑疝、呼吸困难等非常严重的临床症状，危及生命，此时，对机体内部免疫功能起调节作用的神经-免疫信号网络很可能发挥着主要的作用，NK细胞数量激增很可能与该信号通路活化明显有关，对于相关分子机制研究后期将进行深入分析。

对于本研究发现的在重型HFMD患者体内，NK细胞的表达变化与患者感染病毒（CoxA16或EV71感染）类型相关的结果，笔者认为与致病病毒的毒性强弱有关；本研究中，CoxA16感染重型患者NK细胞减低，而EV71感染重型患者NK细胞增高。造成该现象的原因一方面推测为因CoxA16致病毒性相对EV71较弱，所以其刺激NK细胞活化的能力也相对较弱；另一方面也说明EV71的致病机制与其他肠道病毒致病机制不同，这也可能是其致病分子机制目前还尚无定论的原因之一。

参考文献

［1］Liu W，Ji H，Shan J，et al.Spatiotemporal Dynamics of handfoot-mouth disease and its relationship with meteorological factors in Jiangsu Province，China［J］.PLoS One，2015，10（6）：e0 131 311.

［2］Liu Y，Wang X，Liu Y，et al.Detecting spatial-temporal clusters of HFMD from 2007 to 2011 in Shandong Province，China［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63 447.

［3］Nassef C，Ziemer C，Morrell D S.Hand-foot-and-mouth disease：a new look at a classic viral rash［J］.Curr Opin Pediatr，2015，27（4）：486-491.

［4］Wang S M，Liu C C.Enterovirus 71：epidemiology，pathogenesis and management［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2009，7（6）：735-742.

［5］Liu Z F，Gui J J，Hua Q H，et al.Molecular epidemiology and evolution of human enterovirus 71 and hand，foot and mouth disease［J］.Yi Chuan，2015，37（5）：426-435.

［6］Wang S M，Lei H Y，Liu C C.Cytokine immunopathogenesis of enterovirus 71 brain stem encephalitis［J］.Clin Dev Immunol，2012，2012（60）：876 241.

［7］Mao Q，Wang Y，Yao X，et al.Coxsackievirus A16：epidemiology，diagnosis，and vaccine［J］.Hum Vaccin Immunother，2014，10（2）：360-367.

［8］Bian L，Wang Y，Yao X，et al.Coxsackievirus A6：a new emerging pathogen causing hand，foot and mouth disease outbreaks worldwide［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2015，13 （9）：1061-1071.

［9］Campbell K S，Hasegawa J.Natural killer cell biology：an update and future directions［J］.J Allergy Clin Immunol，2013，132（3）：536-544.

［10］Muntasell A，Vilches C，Angulo A，et al.Adaptive reconfiguration of the human NK-cell compartment in response to cytomegalovirus：a different perspective of the host-pathogen interaction［J］.Eur J Immunol，2013，43（5）：1133-1141.

［11］中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南（2010年版）［S］.北京，2010.

［12］中华人民共和国卫生部.肠道病毒71型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识（2011年版）［S］.北京，2011.

［13］Mandelboim O，Lieberman N，Lev M，et al.Recognition of haemagglutinins on virus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells［J］.Nature，2001，409（6823）：1055-1060.

［14］Lam R A，Chwee J Y，Le Bert N，et al.Regulation of selfligands for activating natural killer cell receptors［J］.Ann Med，2013，45（4）：384-394.

［15］Orange J S.Human natural killer cell deficiencies and susceptibility to infection［J］.Microbes Infect，2002，4（15）：1545-1558.

［16］田志刚.NK细胞新理论对重大疾病的新解释［J］.中国免疫学杂志，2002，18（2）：75-78.

［17］Lisnić V J，Krmpotić A，Jonjić S.Modulation of natural killer cell activity by viruses［J］.Curr Opin Microbiol，2010，13（4）：530-539.

［18］Schafer J L，Ries M，Guha N，et al.Suppression of a natural killer cell response by simian immunodeficiency virus peptides［J］.PLoS Pathog，2015，11（9）：e1 005 145.

［19］Dong S，Geng L，Shen M D，et al.Natural Killer Cell Activating Receptor NKG2D is Involved in the immunosuppressant effect of mycophenolate mofetil and infection of hepatitis B virus［J］.Transplant Proc，2015，47（6）：1796-1801.

Clinical Significance of the NK Cells Expression Changes in HFMD Patients Infected by CoxA16 with Different Severity Degrees

LI Li.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：008-012

【Abstract】Objective：To compare and analyze the different expression of NK lymphocytes subset in peripheral blood in children with different severity degree of hand-foot-mouth disease（HFMD） after CoxA16 infection.Method：The peripheral blood samples of 54 CoxA16 infected patients from the confirmed cases with foot-and-mouth disease in the infectious disease department in our hospital from April 2015 to August 2015 were collected and devided into 3 groups according to the difference of severity degree，16 patients in the mild cases group，18 in the severe cases group，and 20 in critical illness cases group.separately.The other 18 peripheral blood samples of EV71 infected severe HFMD patients were selected as the control group.All the patients aged 15 to 24 months.The expression of NK lymphocyte in all cases above were detected by flow cytometry.Result：Compared to the reference value of NK cells in healthy children，the percentage of NK cells in peripheral blood was obviously elevated in the mild cases group，while it showed decreasing expression in the severe cases group patients but evident increasing in the critical illness cases group.Moreover，it had significantly differences between either the mild cases group and the two severe symptom cases（contain the severe cases group and critical illness cases group） or the severe cases group and critical illness cases group（P＜0.05）.Besides，contrasted to the decreasing expression of NK cells in CoxA16 infected cases，it showed obvious rising of NK cells in EV71 infected severe patients，of which the difference was also statistic significant（P＜0.05）.Conclusion： The expression of NK cells in peripheral blood were associated with the severity of the clinical manifestations in different CoxA16 infected patients，what’s more，it related to the different type of virus in the severe type cases.Thus，we predict that except the influence of the pathogenicity of different virus，the immune function of NK cells is more affected by the critical clinical symptom in critical condition.

【Key words】NK cells； Coxsackievirus A16； Hand-foot-mouth disease； EV71； Clinical significance

*基金项目：云南省科技计划青年项目（2012FD100）；云南省卫生科技计划项目（2014NS052）

通信作者：李莉

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.003

收稿日期：（2015-12-30） （本文编辑：蔡元元）