从PI3k/Akt通路研究山茱萸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制*

刘彩容陈克芳黄启辉



从PI3k/Akt通路研究山茱萸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制*

刘彩容①陈克芳②黄启辉②

【摘要】目的：了解山茱萸对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用机制。方法：选取84只雄性Wistar大鼠，按随机数字表法分三组，分别为对照组、缺血再灌注组（I/R组）和治疗组，每组28只。采用结扎大鼠冠状动脉左前降支法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，对照组在左冠状动脉前降支处仅穿线不结扎，I/R组在再灌注前5 min时尾静脉注射0.9%氯化钠注射液1 mL，治疗组在再灌注前5 min时尾静脉注射山茱萸药液1 mL，观察记录各组大鼠心肌缺血情况和心电图信息。结果：与对照组比较，I/R组及治疗组大鼠FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升；与I/R组比较，治疗组FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：山茱萸及其有效成分通过PI3K/Akt通路，对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护机制的实现起到了十分重要的作用。

【关键词】山茱萸； 心肌缺血； 再灌注损伤； PI3k/Akt通路

①广州市白云区第三人民医院 广东 广州 510000

②中山大学孙逸仙纪念医院

First-author’s address：The Third People’s Hospital of Baiyun，Guangzhou 510000，China

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）对于人体健康的恢复以及相关治疗活动的开展有着极大的阻碍作用，相关医疗机构必须加强对其的重视，积极的采取措施对其进行研究，从而最大程度的避免心肌缺血再灌注损伤的产生。本文就以PI3k/Akt通路研究为基础对山茱萸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制进行分析与探讨。

1　材料与方法

1.1实验材料 选择24～25周龄的84只雄性Wistar大鼠为研究对象，体重均220～250 g，本次实验大鼠的提供机构均为中山大学实验动物中心。将84只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为正常对照组，缺血再灌注组（I/R组）以及治疗组，每组各为28只。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注损伤模型制备方法 在进行实验之前所有大鼠均采取禁食处理，禁食时间为8 h左右，期间保障自由饮水［1］。实验时以20%的氨基甲酸乙醋对大鼠进行腹腔注射麻醉［2］，仰卧位固定大鼠四肢，并于四肢皮下插入心电仪电极，对大鼠心电图的信息进行观察与记录。同时对大鼠进行气管插管手术，切开颈部气管，插入导管后进行固定，导管对连接动物呼吸机，通气量8 mL/kg［3］。在实验过程中对大鼠的正常呼吸进行维护，呼吸频率控制在60～70次/min即可。暴露大鼠心脏，即在心脏脉动最明显的部位打开胸腔，剪开心包，继而让心脏完成暴露［4］。选择左冠状静脉为标志物进行缝合，缝合针的型号为7-0无创代针，缝合位置为左心耳根部下方2 mm处，在进行缝合处理时要对大鼠的心电图进行密切关注，当心电图保持稳定10 min后再对左冠状动脉降支进行活结结扎，从而造成心肌缺血［5］。缺血的判定标准为前降支动脉供血区呈现出苍白色或者青紫色，心电图ST-T融合表现为太高状态。大鼠被缺血30 min后，松开线绳进行冠脉行再灌注，时间为2 h，完成心肌缺血再灌注损伤模型。对照组在左冠状动脉前降支处进行穿线，不结扎；I/R组在再灌注前5 min时尾静脉注射0.9%氯化钠注射液1 mL；治疗组在再灌注前5 min时尾静脉注射山茱萸药液1 mL。

1.2.2中药给药量的确定 本次实验中大鼠山茱萸的给药量遵循中药药理实验的相关指导，大鼠的低等用药量一般情况下均为单位体重人用药量的10倍，中等用药量为单位体重人用药量的20倍，高等用药量为单位体重人用药量的40倍，本次研究中的山茱萸多糖及总苷的人用药量即在此基础上结合中药提纯率相应计算得出［6］。

1.2.3大鼠血清CK-MB和LDH的测定方法 再灌注2 h后，采集大鼠腹部动脉血3 mL，所采集的血样在4 ℃、4000 r/min下离心10 min，取上清液进行分装，-80 ℃下保存。运用ELISA法对血清CK-MB以及LDH活性进行测定，为下一步研究的进行提供依据［7］。

1.3统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计学分析，大鼠心机缺血及梗死面积百分率以［±D（x）］形式表示，计量资料以（±s）形式表示，行t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠心肌梗死面积比较 三组大鼠心肌I/R后的缺血区面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，I/R组和治疗组大鼠心肌梗死区面积均有所增加，治疗组梗死区面积低于I/R组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　各组大鼠心肌梗死面积比较［±D（x）］ %

表1　各组大鼠心肌梗死面积比较［±D（x）］ %

组别　缺血区面积　梗死区面积对照组（n=28）　45.65±2.34　26.80±4.76治疗组（n=28）　46.23±1.89　43.54±2.38 I/R组（n=28）　47.22±2.65　45.66±2.87

2.2各组大鼠心肌I/R后心功能比较 与对照组比较，I/R组及治疗组大鼠FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；与I/R组比较，治疗组FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2　各组大鼠I/R后超声心动图结果比较（±s）/［±D（x）］

表2　各组大鼠I/R后超声心动图结果比较（±s）/［±D（x）］

组别　LVDd（mm）　LVESV（mm）　LVEDV（mm）　FS（%）　EF（%）对照组（n=28）　5.45±0.18　0.04±0.11　0.30±0.03　58.8±1.42　91.8±1.11治疗组（n=28）　5.96±0.43　0.13±0.03　0.45±0.04　41.3±1.45　85.6±5.32 I/R组（n=28）　6.64±0.26　0.20±0.04　0.60±0.04　21.3±1.95　64.5±4.41

3　讨论

心肌缺血再灌注损伤是指患者出现心机缺血的状况后，心肌血流得到恢复，使得心机结构，以及组织受到一定损害的现象。心肌缺血灌注损伤可能诱发患者出现心肌梗死，或者梗死面积扩大等不可逆损伤，这对于患者的健康与治疗造成严重影响。因此，和其他心血管类疾病相比，心肌缺血再灌注损伤的病死率更高，相关医疗机构必须加强对心肌缺血再灌注损伤的重视［8-9］。心肌缺血灌注损伤之所以会发生，主要是因为在心肌缺血状况下，患者体内所含有的氧自由基的数量在一定程度上被提升，并且细胞内钙含量也呈现上升趋势。此外，在心肌缺血的前提下，白细胞被激活的几率被提升，释放大量促炎细胞因子，进而增加血管的通透性。此外，过多的白细胞被激活，使得组织受到进一步损伤。动物以及细胞实验显示，中药复方制剂以及中药提取物在缓解心肌缺血灌注损伤方面效果显著，这是因为中药提取物或中药复方制剂会对MIRI的多种因素造成影响，进而使得心肌细胞的存活率被提升，从而对缺血再灌注心肌进行保护。

本文研究结果显示，I/R后的心功能方面，与对照组比较，I/R组与治疗组大鼠的FS和EF均降低，LVDd、LVESV、LVEDV均上升，差异均有统计学意义（P＜0.05），与I/R组比较，治疗组FS和EF均上升，LVDd、LVESV、LVEDV均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。这主要归咎于缺血再灌注损伤补救激酶信号通路，它主要由PI3K-蛋白激酶B以及ERK1/2组成，其中，PI3K-蛋白激酶B就是我们常说的Akt。相关研究证明，PI3K/Akt通路对于再灌注损伤保护作用的发挥有着极为重要的作用，主要体现在以下方面：首先，PI3K/Akt能够阻止线粒体通透性转换孔的开放，促进肌浆网实现对Ca2+的获取。同时，PI3K/Akt通路的建立也能够促进抗细胞凋亡途径的恢复［10-11］。PI3K主要存在于细胞膜上，Akt通过PI3K的产物接触细胞膜上的磷酸后呈现为被激活的状态。在PI3K/Akt被激活的状态下，实现向细胞核的转运，并和相关部位的底物蛋白产生反应，进而把底物蛋白特定部位结构磷酸化，这主要是因为被硫酸化的物质有苏氨酸以及特定部位的丝。被激活的Akt同时能够让细胞核，以及细胞质内的多种底物被磷酸化［12-13］。譬如，ENOS被磷酸化后会生成内源性的NO，这种NO能够使得S6激酶呈现被激活状态。又譬如，糖原被磷酸化后会促进激酶-3β的合成。此外，磷酸化过程的进行也能够促进相关基因的表达以及糖原代谢等，这些活动能够加强K+通道的开放，进而保护缺血再灌注损伤心肌。因此，Akt常常扮演的角色为网络信号通路的调节器。相关学者研究还表明，被磷酸化的GSK-3β，能够降低线粒体外膜腺甘酸转移速度，进而调节VDAC磷酸化水平，抑制MPTP开放过程［14-15］。同时，PI3K/Akt能够保护线粒体功能，进而减轻患者心肌缺血再灌注损伤。

相关药理学研究发现，山茱萸的有效的化学成分主要为苷类、多糖体以及有机酸等，在服用之后能够清除自由基，对兴奋作用进行免疫［16-18］。山茱萸多糖对于免疫低下的小鼠，在细胞免疫功能以及体液免疫促进方面作用明显。同时，山茱萸总苷具有较为明显的杀菌和抗炎效果。研究发现：山茱萸能够使大鼠心肌梗死面积呈现减小趋势，改善其心功能。山茱萸能够保护大鼠心肌，是因为其能够抑制炎性介质释放，并改善心肌细胞钙超载状况。此外，山茱萸也能够发挥线粒体功能，在心肌细胞凋亡抑制方面也存在一定的优势［19-20］。相关人员发现，山茱萸多糖和总苷在抑制心肌细胞凋亡机制方面有所差异，山茱萸多糖通过细胞膜受体信号通路，而山茱萸总苷则通过线粒体通路抑制细胞凋亡。

综上所述，传统中药山茱萸及其有效成分通过PI3K/Akt通路，作用于线粒体ATP依赖性钾通道，改善线粒体功能、减少细胞凋亡，具有十分重要的临床意义。

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Study on Mechanism of Action of Cornus Officinalis for Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

LIU Cai-rong，CHEN Ke-fang，HUANG Qi-hui.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：024-027

【Abstract】Objective：To learn the protective mechanism of action of cornus officinalis for rats with myocardial ischemia-reperfusion injury.Method：Eighty-four male Wistar rats were divided into three groups according to the random number table，the control group，the ischemia-reperfusion group（I/R group） and the treatment group，twenty-eight rats in each group.The model of myocardial ischemia-reperfusion injury in rats was developed by ligaturing the left descending anterior coronary artery，the rats in the control group were only thread while rats in the I/R group were given 1 mL 0.9% sodium chloride injection through the tail vein before reperfusion and rats in treatment group were given 1 mL cornus officinalis injection through the tail vein.The myocardial ischemia and electrocardiograph information of all groups were observated and recorded.Result：Compared with the control group，FS and EF of the rats in I/R group and treatment group were decreased，but LVDd，LVESV and LVEDV were increased，while compared with the I/R group，FS and EF of the rats in treatment group were increased，but LVDd，LVESV，LVEDV were decreased，the differences were all statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：Cornus officinalis may play a very important role for realizing the protective mechanism in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury through PI3k/Akt pathway.

【Key words】Cornus officinalis； Myocardial ischemia； Ischemia-reperfusion injury； PI3k/Akt pathway

*基金项目：广东省中医药局科研课题（20151174）

通信作者：刘彩容

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.007

收稿日期：（2015-12-07） （本文编辑：刘蕾）