猴脑选择性超深低温断血流复苏对基质金属蛋白酶9及转化生长因子β1表达水平的影响*

应建有徐蔚



猴脑选择性超深低温断血流复苏对基质金属蛋白酶9及转化生长因子β1表达水平的影响*

应建有①徐蔚②

【摘要】目的：观察猴脑选择性超深低温断血流复苏对基质金属蛋白酶9（MMP-9）和转化生长因子β1（TGF-β1）表达的变化影响，探讨超深低温相关脑保护机制。方法：选择9只成年雄性健康恒河猴作为研究对象，随机分为常温组2只与超深低温组7只，分别建立等温及超深低温断血流复苏实验模型，分别对大脑皮质脑组织切片用MMP-9、TGF-β1抗体进行免疫组化染色、图像分析，对每张切片的平均灰度值进行统计学分析，比较两组MMP-9、TGF-β1含量和平均灰度值的情况。结果：超深低温组神经细胞MMP-9表达下调，而TGF-β1表达增高。结论：超深低温能抑制MMP-9的表达，增加TGF-β1的表达，促进受损脑细胞的损伤修复，提高了脑细胞对缺血缺氧损害的耐受性，抑制细胞的凋亡，是缺血缺氧情况下脑重要的内源性保护机制之一。

【关键词】猴脑； 超深低温； 基质金属蛋白酶9（MMP-9）； 转化生长因子β1（TGF-β1）

①河南省漯河市中心医院 河南 漯河 462000

②昆明医科大学第二附属医院

First-author’s address：Central Hospital of Luohe City，Luohe 462000，China

低温对缺血性脑损伤有保护作用由Aleen于1939年最先报道，此后国内外学者对低温，尤其是亚低温（32～35 ℃）从细胞因子、递质、受体、蛋白质、酶、离子通道及基因表达等方面进行了相关的基础和临床研究［1］，但对超深低温脑保护的作用机制的研究尚在进一步探索中。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）和转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是重要的细胞因子［2-3］，它们参与脑缺血缺氧过程中的损伤修复，其在超深低温条件下的脑保护作用的研究目前尚没有明确的报道。本研究通过检测猴大脑皮质中MMP-9与TGF-β1在常温与选择性超深低温断血流复苏后的表达的水平变化程度，探索脑选择性超深低温断血流复苏对MMP-9 及TGF-β1表达的影响，将有助于研究其在脑的不同低温脑保护技术中的作用变化，旨在为MMP-9抑制剂及TGF-β1的临床应用提供一定的理论依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物 选取9只成年雄性健康恒河猴（中国科学院昆明动物研究所提供）作为研究对象，平均体重（9.1±2.5） kg，年龄4～10岁，随机分为常温组2只与超深低温组7只。

1.2实验仪器与药物 包埋机（Histocentre Shandon，英国），脱水机（Pathcentre Shandon，英国） ，漂片机 （3120058 Section Bath Shandon，英国），切片机（HM-325，德国Microm），烤片机（3120061 Hotplate Shandon，英国），二抗显色系统（EnvisionTM System，丹麦DAKO公司），MMP-9、TGF-β1多克隆抗体（福建迈新生物技术开发有限公司），高清晰彩色病理图文报告分析系统 （同济医科大学千屏影像公司，HPIAS-1000），光学显微照相装置（TK-C 1381EG，日本）。

1.3实验方法

1.3.1建立猴脑选择性超深低温断血流复苏实验模型 超深低温组通过建立脑局部体外循环，脑缺血10 min后经降温系统输入4.0 ℃林格液维持脑温于14.3～16 ℃ 60 min，使脑及中心体温恢复正常，恢复猴自然状态。常温组输入38.0 ℃林格液，脑温不被降低，其余均同超深低温组模型［4］。

1.3.2标本的取材与固定 常温组实验猴于灌注死亡后直接取额叶脑组织以4%的多聚甲醛固定、石蜡包埋。低温组实验猴饲养到术后12周后麻醉开胸处死，开颅手术取出全脑组织，取额叶脑组织以4%多聚甲醛固定。

1.3.3免疫组化染色 蜡块经切片（切片5 μm，90 ℃烤2 h）、脱蜡（二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min）、水化（70%酒精、95%酒精及无水酒精各1～2 min，蒸馏水洗3 min）、磷酸盐缓冲液漂洗（3 min/次，漂洗3次）、抗原修复、切片。免疫组化染色按实验说明操作：（1）阻断内源性过氧化物酶活性（阻断剂一滴加于湿盒，放置常温10 min）；（2）PBS冲洗3次，3 min/次；（3）擦干标本周围PBS液，加一滴第一抗体于湿盒，放置于4 ℃过夜；（4）PBS冲洗3次，5 min/次；（5）擦干标本周围PBS液，加一滴聚合物增强剂于湿盒，放置于室温20 min；（6）PBS冲洗3次，3 min/次；（7）清除PBS液，加酶标抗鼠聚合物一滴，放置于室温30 min；（8）PBS冲洗3次，3 min/次；（9）擦干标本周围PBS液，加新鲜配制的DAB显色液，于显微镜下调控显色程度，在3～5 min后阳性染色显著、且背景尚未染色前，放置于蒸馏水中终止显色，并用水冲洗，再经苏木素复染、脱水、透明及树胶封片后备用。

1.4结果判断 MMP-9由包括巨噬细胞、中性粒细胞、毛细血管内皮细胞及正常细胞在内的多种细胞合成分泌并表达相应的受体，TGF-β1亦由几乎所有类型的细胞合成分泌，免疫组化染色阳性反应为黄色-棕黄色颗粒。应用Clour Video Camera和Nikon显微镜对每张切片采集10个视野图像（两人双盲法，光镜400倍视野），用高清晰彩色病理图文报告分析系统检测阳性细胞灰度值（灰度值与染色阳性强度、含量呈反比），取灰度平均值反映MMP-9 及TGF-β1在额叶皮质中的相对含量［5］。平均灰度值表示图像分析中的透光率，若灰度值低，则透光率低，图像染色强，则表明MMP-9及TGF-β1在细胞中的含量高，反之则含量低。

2　结果

常温组实验猴灌注后立即死亡，超深低温组实验猴安全复苏并长期存活，未发现明显神经功能缺失。取9只实验猴额叶标本，经免疫组化、图像分析得到平均灰度值（图1～4），超深低温组MMP-9水平较常温组低，而TGF-β1水平较常温组高，见表1。

3　讨论

人脑是控制运动、感觉、生物节律等一切生命活动的中枢，是全身代谢率最高的器官，重量仅占全身体重的2%，却接受心输出量15%的血液，消耗全身20%的氧量。在脑组织对缺血缺氧耐受时间窗和程度方面，脑组织的耐受性最差，脑组织缺血缺氧4～5 min后，所有需能生化反应将全部停止，从而造成严重的不可逆的神经损害，因此对缺血缺氧后脑保护的研究具有重要的研究价值。

目前研究发现低温具有确切的脑保护作用，并已得到世界的公认。低温引起脑代谢和脑耗氧量的降低，脑组织易于维持和改善氧供需平衡，缓解脑缺血后Na+-K+-ATP酶活性下降、稳定细胞膜和血脑屏障，并减少或抑制多种兴奋性递质和氧自由基的合成与释放，提供了良好的脑保护功能［6］。目前医学界将低温分为轻度低温（33～35 ℃）、中度低温（28～32 ℃）、深低温（17～27 ℃）、超深低温（2～16 ℃），1993年江基尧将28～35 ℃轻中度低温命名为亚低温并被广泛接受，亚低温脑保护在临床神经外科广泛应用于重型颅脑损伤的救治［7-8］。深低温脑保护在上世纪50年代开始得到应用，到20世纪60年代初，脑温在降至12～18 ℃超深低温下，阻断脑部血流60 min并复苏成功，未遗留明显神经功能障碍，但因深低温所致的较严重的全身并发症，目前这一技术尚未推广应用于临床［9］。随着脑保护液、灌注方法及凝血机制等方面的研究不断进展，深低温脑保护机制获得了越来越多的实验依据［10］，深低温技术日趋完善。脑缺血是临床常见的病理过程，脑缺血所引起的神经损伤机制较为复杂，可能涉及多种因素，包括：脑缺血后微循环损害、能量障碍、自由基生成、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、细胞酸中毒、细胞骨架的降解、凋亡基因激活及胶质细胞的反应等［11］。2002年徐蔚等［4］首次采用恒河猴成功建立了选择性脑深低温断血流复苏模型，脑温最低降至12.8 ℃，阻断脑血流60～80 min后复苏成功，未造成明显神经功能障碍，心、肺、肾等重要脏器功能未受损害，脑细胞超微结构亦未见明显异常。该研究表明选择性深低温可显著提高猴脑对缺血缺氧损害的耐受性，如在人类行类似操作亦可能获得相似的结果。脑选择性超深低温断血流复苏技术在不降低中心体温情况下，仅选择性降低脑部温度，最大限度的延长了脑细胞对缺血缺氧耐受的安全时限，避免了全身深低温所造成的严重并发症，为复杂中枢神经系统疾患的临床救治提供了广阔的应用前景。

表1　两组MMP-9、TGF-β1平均灰度值水平比较（±s）

表1　两组MMP-9、TGF-β1平均灰度值水平比较（±s）

组别　MMP-9　TGF-β1常温组（n=2）　113.7±1.9　128.1±7.2超深低温组（n=7）　127.3±5.4　117.5±4.5

图1　常温组MMP-9表达（×400）

图2　超深低温组MMP-9表达（×400）

图3　常温组TGF-β1表达（×400）

图4　超深低温组TGF-β1表达（×400）

文献［12］发现，脑缺血缺氧早期即出现MMP-9表达的升高，MMP-9参与一系列病理过程如血脑屏障破坏、无菌性炎性反应、微血管通透性增加、脑水肿形成等，加重脑损害的程度，应用合成的MMP-9抑制剂可在一定程度上阻止上述病理改变的发生。在本研究中，常温组2只实验猴于灌注后直接死亡，神经细胞大量坏死，MMP-9呈高水平表达，平均灰度为（113.7±1.9），超深低温组中MMP-9表达下调，平均灰度（127.3±5.4），与等温组比较有差异，表明脑缺血过程中MMP-9高水平表达，神经细胞难以生存，并且脑选择性超深低温可以抑制MMP-9及其受体的表达和激活，避免了MMP-9的过量表达对神经细胞的损害。脑组织在正常状态下可表达一定量的MMPs，激活后的MMPs参与正常的生理活动，通过降解细胞外基质而促进血管生成和创伤愈合，但在脑缺血病理状态下，MMPs过度表达起到病理损伤效应，激活后的MMPs可降解细胞外基质，并中断细胞与细胞之间、细胞与基质之间的内在联系和相互作用，造成神经细胞的损伤与死亡［13］。本实验中低温组中有少量MMP-9表达，也表明MMP-9参与并维持着脑组织正常的生理活动。

TGF-β1是一种普遍存在的细胞因子，对多种细胞具有广泛的生物学作用，其中包括神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞，它参与细胞生长、分化、组织修复、炎症、抗氧化及抗凋亡等多种生物过程，提高神经元、神经胶质细胞及内皮细胞的存活与生长，在病理状态下使更多的神经细胞得以生存，体内外实验均已证实了TGF-β1的神经保护作用［14-15］。本实验结果表明，常温组猴脑皮质免疫组织化学染色显示TGF-β1呈低水平表达，平均灰度（128.1±7.2），低温组中TGF-β1表达较常温组明显增加，表明选择性超深低温可较长时间上调TGF-β1及其受体的表达，可能参与了脑缺血缺氧损伤的修复。脑选择性超深低温断血流以及此后再灌注过程中，缺血缺氧的存在将对脑血管及神经细胞造成一定的损伤。有研究表明，TGF-β1作为重要的血管生成调节因子，可诱导血管增生，对血管损伤具有明显的修复作用［16］。急性脑缺血缺氧后，损伤周围脑组织的微血管内皮细胞、蛛网膜中的TGF-β1 mRNA表达增加。本实验中低温组TGF-β1呈持续高水平表达可以认为与血管、神经细胞及轴突再生修复有关。研究证明TGF-β1的表达有两种模式，即早期的普遍表达和后期的损伤相关的表达。本研究也提示选择性超深低温断血流后机体通过上调TGF-β1的表达，降低脑代谢率，提高脑缺血缺氧耐受性，并通过TGF-β1的持续高表达参与细胞的生长分化与组织修复过程，减轻或避免了脑细胞的缺血缺氧性损伤。

综上所述，猴脑选择性超深低温断血流复苏技术通过多种机制抑制了MMP-9的过量表达，同时诱导了TGF-β1的高表达，抑制神经细胞的凋亡，减轻神经功能障碍，有助于神经细胞的生存，是选择性超深低温状态下机体对缺血缺氧性脑损害的内源性代偿机制，具有明确的脑保护作用，但超深低温对两者相互作用的机制有待进一步的研究。

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Effects of Blood Flow Occlusion after Resuscitation Using Selective Cerebral Ultra-profound Hypothermia on the Expression Matrix Metalloproteinases-9 and Transforming Growth Factor-β1 for Monkey

YING Jian-you，XU Wei.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：020-023

【Abstract】Objective：To explore the effects of blood flow occlusion after resuscitation using selective cerebral ultra-profound hypothermia on the expression matrix metalloproteinases-9 and transforming growth factor-β1 for monkey and to investigate the mechanism of brain protection related to ultra deep hypothermia.Method：9 adult male healthy Ganges River monkeys were selected as the research subjects，randomly divided into the normal temperature group of two and the ultra deep low temperature group of seven，the isothermal and ultra deep hypothermic circulatory arrest recovery experimental model were established，and mmunohistochemical staining and image analysis were used to analyze the average gray value of each slice of brain cortex brain tissue sections with MMP-9 and TGF-β1 antibody，the MMP-9，TGF-β1 and the average gray value of the situation in two groups were compared.Result：The expression of MMP-9 was down regulated，while the expression of TGF-β1 was increased in the ultra deep hypothermia group.Conclusion：Selective ultra-profound hypothermia can attenuate MMP-9 expression and promote TGF-β1 expression which inhibit apoptosis，improve the tolerance of nerve cells to ischemia and hypoxia and promote the restoration of damaged nerve cells，it is one of the important endogenous protective mechanisms of cerebral ischemia and hypoxia.

【Key words】Monkey brain； Ultraprofound hypothermia； Matrix metalloproteinases-9（MMP-9）；Transforming growth factor-β1（TGF-β1）

*基金项目：教育部科学技术研究重点项目（02141）；云南省自然科学基金（2003C0010Z）

通信作者：应建有

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.006

收稿日期：（2015-11-16） （本文编辑：李颖）