无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究*

房冬冬刘振赵金娇周慧庞磊李长贵



无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究*

房冬冬①刘振①赵金娇①周慧①庞磊①李长贵①

【摘要】目的：建立新型的无症状高尿酸血症小鼠模型。方法：选取雄性尿酸氧化酶基因敲除杂合子C57BL/6J小鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只，两类小鼠均按随机数字表法分为对照组和模型组，每组各10只，模型组给予高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液（1次/d，250 mg/kg）腹腔注射。分别于造模前和造模后第1、2、3、4周时鼠尾静脉取血检测小鼠血清尿酸水平（UA），并于造模后第5周取小鼠肾脏行病理切片及HE染色。结果：造模1周后，两模型组小鼠血清尿酸水平均较对照组明显升高，且杂合子模型组尿酸水平明显高于野生型模型组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但肾脏病理切片HE染色显示，两种小鼠对照组和模型组均无明显病理变化。结论：以高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液腹腔注射处理的尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠所构建的高尿酸血症动物模型具有尿酸值高，模型稳定的特点，为较理想的小鼠高尿酸血症动物模型。

【关键词】高尿酸血症模型； 尿酸氧化酶基因敲除杂合子小鼠； 血清尿酸

①青岛大学附属医院 山东 青岛 266003

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China

尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物。在约1500万年前人类由于基因突变失去了尿酸氧化酶基因［1］，因此人类的尿酸水平高于其他物种，这种改变有利于人类适应当时的生存环境，但尿酸水平仍控制在一定范围内。现在所谓的高尿酸血症（hyperuricemia）是指嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍导致的血尿酸水平增高［2］。随着人们生活水平的提高及饮食结构的变化，高尿酸血症的发病率日渐增高［3-4］，由于雌性激素的作用尿酸水平在男性中比绝经前女性更高［5-6］。高尿酸血症动物模型，是研究高尿酸血症及筛选降尿酸药物的重要工具［7-9］。目前尚未见尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠制作高尿酸动物模型的报道，本实验对尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠进行高酵母饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射处理，观察其血清尿酸等指标，目的在于获得尿酸值较高且稳定的理想高尿酸血症动物模型。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 选择以C57BL/6J小鼠为背景的尿酸氧化酶基因敲除杂合子小鼠（基因型为Uox+/-）20只及野生型C57BL/6J小鼠（基因型为Uox+/+）20只，均为雄性，6～8周龄，体质量18～25 g，尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠构建于上海南方模式生物研究中心，由本院实验动物中心SPF级动物饲养房饲养。

1.1.2仪器和试剂 日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪；Nikon90i显微镜；高酵母饲料（北京科澳协力饲料有限公司）；氧嗪酸钾盐（美国Aldrich公司）。

1.2实验方法

1.2.1动物分组及建模 杂合小鼠及野生型小鼠适应性饲养7 d后，按随机数字表法分别分为对照组和模型组，每组10只。模型组小鼠予以高酵母饲料饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射（1次/d，250 mg/kg），对照组小鼠饲以普通小鼠颗粒饲料，并给予同体积蒸馏水腹腔注射。

1.2.2观察指标与测定方法 杂合小鼠和野生型小鼠均分别于造模前和造模后第1、2、3、4周时鼠尾静脉取血，室温下静置1 h后，3500 rpm，4 ℃离心15 min，收集血清，应用全自动血液生化仪检测记录血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CH）、谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）的水平，并对所得数据进行分析。

1.2.3病理切片及HE染色 造模第5周将小鼠麻醉后，迅速打开腹腔，取肾脏，置于4%的甲醛溶液中固定，脱水，常规石蜡包埋，包埋后肾脏纵切以观察肾门、肾盂结构，苏木素-伊红染色，封片，于Nikon90i显微镜下观察组织切片。

1.3统计学处理 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计量资料均以（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1四组小鼠不同时期血尿酸水平比较 造模前，各组小鼠血尿酸水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。造模1～4周，杂合子模型组小鼠血尿酸水平与造模前比较均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。野生型模型组小鼠血尿酸水平1～4周也明显升高，与给药前比较差异有统计学意义（P＜0.05）；两模型组小鼠血清尿酸水平均高于对照组（P＜0.05）；杂合子模型组小鼠与野生型模型组小鼠组比较，造模后1～4周尿酸水平升高更明显，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1　四组小鼠不同时期血尿酸水平比较（±s） μmol/L

表1　四组小鼠不同时期血尿酸水平比较（±s） μmol/L

*与野生型对照组比较，P＜0.05；△与杂合子对照组比较，P＜0.05；#与野生型模型组比较，P＜0.05

组别　　造模前　　造模1周　　造模2周　　造模3周　　造模4周野生型对照组（n=10）　164.4±12.8　164.8±14.0　167.4±13.0　168.5±15.9　164.9±9.07杂合子对照组（n=10）　161.5±17.7　167.1±14.4　167.3±13.7　169.3±13.1　167.0±12.9野生型模型组（n=10）　163.3±15.8　 237.6±12.4*　250.2±10.5*　247.7±16.8*　242.4±12.4*杂合子模型组（n=10）　161.9±20.5　 284.1±35.9△#　288.6±22.7△#　285.5±18.1△#　281.0±24.0△#

图1　造模后1～4周Uox+/+和Uox+/-小鼠尿酸水平

2.2各组小鼠血肌酐、尿素氮、甘油三酯、胆固醇，谷丙转氨酶及谷草转氨酶的变化 造模前后，所有模型组小鼠血肌酐、尿素氮、甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平与相应对照组比较无明显差异。

2.3各组小鼠肾脏病理切片HE染色比较 建模5周后处死小鼠留取肾脏标本进行HE染色，光镜下观察，模型组小鼠肾皮质、髓质结构清晰，未见明显病理改变，与各自对照组比较无显著差别，见图2～3。

图2　肾脏病理切片HE染色结果（×100）

图3　肾脏病理切片HE染色结果（×400）

3　讨论

在中国高尿酸血症患病率高达5.0%～23.5%，已接近欧美发达国家水平［10］。近年来国内外研究资料显示，高尿酸血症患者中约20%可发生痛风。另外，作为心脑血管疾病的独立危险因素，高尿酸血症可诱发和加重动脉粥样硬化性疾病，增加心脑血管疾病发病率和死亡率［11-13］，同时，高尿酸血症也与代谢综合征、肾脏疾病密切相关［14-18］。人类在进化过程中尿酸氧化酶基因失活，导致嘌呤代谢的终产物以尿酸的形式存在，这是人类易患高尿酸血症的重要原因［19-20］，当然这还与多种因素有关［21-22］。而低级动物体内却能产生尿酸氧化酶（Uox），它可将尿酸分解为更易溶于水的小分子尿囊素排出体外，这是许多低级动物（包括小鼠）维持尿酸稳态的主要途径。

目前国内外建立高尿酸血症动物模型的方法主要有4类，分别为酵母法、补充尿酸或尿酸前体法、尿酸酶抑制剂法及破坏尿酸酶基因法［23］。传统的对野生型C57BL/6J小鼠进行药物刺激造模的方法血尿酸升高并不理想，存在尿酸值不稳定、小鼠状态差等缺点，不适宜进行长期实验。尿酸氧化酶基因敲除后，小鼠可出现高尿酸血症和痛风症状，成为与人类高尿酸血症发病机制非常相似的自发性高尿酸血症小鼠动物模型。但1994年文献报道的模型存在下列缺陷：（1）尿酸氧化酶基因缺失的纯合子小鼠于出生后4周内有超过一半死亡；（2）该基因敲除小鼠背景为129品系，具有免疫排斥，无法在小鼠体内模拟人类的发病过程；（3）纯合子小鼠血尿酸水平是杂合子及野生型小鼠的10倍余，合并致死性肾脏疾病等，从而无法对该模型进行长期观察及实验。

本课题组应用TALEN靶向基因修饰技术将C57BL/6J小鼠的尿酸氧化酶基因敲除，构建了自发性高尿酸血症小鼠模型，但与Uox+/+小鼠和Uox+/-小鼠相比，Uox-/-小鼠的出生率约15.8%，低于孟德尔遗传定律的25%，而且Uox-/-小鼠死亡率较高。Uox+/-小鼠的出生率约53.3%，死亡率仅4.45%。基于Uox-/-小鼠的出生率较低，死亡率较高，价格昂贵，本实验选用Uox+/-小鼠进行高尿酸模型研究。实验结果显示杂合子小鼠高酵母饲养+氧嗪酸钾溶液腹腔注射造模后血尿酸升高明显高于野生型小鼠造模组，差异有统计学意义（P＜0.05）。可应用此模型对受试药物进行实验研究。

本实验认为对杂合子小鼠高酵母饲养并予以腹腔注射氧嗪酸钾盐法可建立较理想的小鼠高尿酸血症动物模型。但本法仍不能形成持久的高尿酸血症是其不足之处。将高酵母饲养与尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾盐腹腔注射序贯应用或改变给药方式，以期获得更可靠的的高尿酸血症动物模型是笔者下一步的实验研究方向。

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Establish and Primary Research of Asymptomatic Hyperuricemia Animal Model

FANG Dong-dong，LIU Zhen，ZHAO Jin-jiao，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：016-019

【Abstract】Objective：To establish a new type of asymptomatic hyperuricemia model in mice.Method：Twenty male urate oxidase gene knockout heterozygous C57BL/6J mice and twenty wild-type C57BL/6J mice were selected as the objects，which were randomly divided into control group and model group according to the random number table respectively，10 mice in each group，the model group was given yeast-rich feed and potassium oxonate suspension（1 time/d，250 mg/kg） by intraperitoneal injection.The blood UA were detected before and 1，2，3，4 weeks after molding.The pathological sections and HE staining of mouse kidney were also performed at the 5th week after the molding.Result：After 1 week，the model group mice’s serum uric acid levels were obviously higher than the control group，and uric acid levels in heterozygous model group was obviously higher than that of the wildtype model group，the differences were statistically significant（P＜0.05），but the kidney pathological HE staining showed there were no changes in the two kinds of mice between the control group and the model group.Conclusion：The hyperuricemia animal model constructed by urate oxidase gene knockout heterozygous mice feeding with yeast-rich feed and given oxonic acid potassium salt suspension peritoneal injection treatment shows characteristics of high uric acid value and high stability，which conclusions to an ideal animal model in mice for asymptomatic hyperuricemia.

【Key words】Hyperuricemia model； Uric acid oxidase gene knockout heterozygous mice； Serum uric acid

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371272）

通信作者：李长贵

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.005

收稿日期：（2016-03-14） （本文编辑：刘蕾）