姜黄素对Aβ诱导的AD大鼠β—APP和BACE1基因表达的影响

韩玉生等

摘要：目的 探讨姜黄素（curcumin）对老年性痴呆（Alzhelmer'sdisease，AD）大鼠海马区β-淀粉样前体蛋白（amyloid protein precursor，APP）和β-分泌酶（amyloidβsecretase1，BACE1）基因表达的影响。方法 采用Aβ1-40右侧海马区注射，制备AD大鼠模型，腹腔注射姜黄素给予治疗，采用RT-PCR法检测海马组织中β-APP和BACE1mRNA表达。结果 与正常组相比，模型组大鼠海马区神经元中β-APPmRNA和BACE1mRNA表达明显升高；与模型组相比较，姜黄素各剂量组β-APPmRNA和BACE1mRNA表达有不同程度降低，差异均有显著性。结论 姜黄素可通过对BACE1mRNA调控作用，阻断β-APP裂解进程，抑制Aβ在脑内生成与沉积，从而减少Aβ对神经元毒性作用。

关键词：姜黄素；老年性痴呆；β-APPmRNA；BACE1mRNA

研究表明，Aβ沉积是AD病理机制的中心环节和治疗靶点， AD治疗的关键在于如何抑制Aβ的生成和代谢。姜黄素能够有效地抑制Aβ的生成和聚集，从而改善AD学习记忆能力A减退和认知功能障碍 [1-2] ，但其具体机制仍然不明确，因此我们进行如下研究。

1 资料与方法

1.1 实验动物与分组 雄性SD大鼠，体重（250±20）g，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK黑2008004。给予充足水和食物常规饲养1w后进行实验。实验前经Morris水迷宫筛选，将大鼠随机分成正常组、假手术组、模型组、姜黄素组低剂量组和姜黄素高剂量组，每组10只。

1.2 主要试剂与仪器 纯度99%的姜黄素和Aβ1-40由Sigma公司生产；RT-PCR引物、Trizol RNA抽提试剂盒（Invitrogen）；逆转录试剂盒及PCR试剂和DNA marker（AKARA公司）；琼脂糖和溴化乙啶（美国Amresco公司）。

淮北正华生产的大鼠脑立体定位仪和Morris水迷宫；上海安亭TGL-16G台式离心机；德国Eppendorf公司5331型PCR扩增仪；美国UVP公司GDS-8000型凝胶成像分析系统；日本岛津紫外分光光度计。

1.3 模型制备 Aβ1-40用无菌生理盐水稀释后在37℃恒温箱中孵育7d，置于-20℃冰箱中保存备用。大鼠经10%的水合氯醛麻醉，固定在大鼠脑立体定位仪上，剪去头部毛发，常规消毒。参考《大鼠脑立体定位图谱》[3]沿大脑矢状线切开皮肤暴露出颅骨，注射点选择：前囟后3mm，中线向右旁开2mm，垂直进针3.5mm，缓慢注射Aβ1-40溶液2ul（10ug），5min内注射完，留针5min。颅骨孔用牙科泥封堵后，常规缝合头部的皮肤和局部消毒。假手术组除注入等量无菌双蒸水外其余处置同模型组。术后大鼠分别单笼饲养直至完全清醒。

1.4给药方法 在术后24h动物清醒后开始给药。姜黄素用二甲基亚砜（DMSO）溶解，低剂量组和高剂量组分别按150 mg/kg 、300 mg/kg浓度腹腔注射，正常组、假手术组、模型组大鼠分别腹腔注射等体积的二甲基亚砜，连续给药14d 。

1.5指标检测 各组大鼠在给药14d后麻醉，心脏灌注生理盐水后取出大脑，在冰上分离海马组织用于RT-PCR法检测大鼠海马区脑组织β-APPmRNA和BACE1mRNA表达。具体操作用严格按试剂盒说明书进行。

1.6 RT-PCR引物设计 β-APPmRNA引物序列：上游5-CCCATCAGGGACCAAAACC3'，下游5'GAAGGGCATCGCTTACAAACT3'，长度218bp；BACE1mRNA引物序列：上游5'TTCGTTTGCCCAAGAAA GTAT3'，下游5'GTAGGTATTGCTGAGGAAGGA3'，长度219 bp；β-actin引物序列：上游5-CTCGCTGTCCACCTTCCA-3下游5'GCTGTCACCTTCACCGTTC 3'，长度256 bp。由大连宝生物设计合成。

1.8 数据统计 实验数据以均数±标准差（x±s）来表示，用SPSS18.0进行统计，采用单因素方差分析，各组间比较t检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 BACE1mRN和β-APP mRNA在各组大鼠海马组织中表达 正常组和假手术组BACE1和β-APP mRNA表达呈现出较暗的条带，模型组大鼠海马区BACE1和β-APP mRNA表达明显增强，表现为高亮强度的条带。姜黄素低、高剂量组在不同程度上降低BACE1和β-APP mRNA的表达。结果见表1与图。

图1

3 讨论

AD最基本的病理改变是老年斑（senile plaque，SP），"β淀粉样蛋白级联假说"认为，由β-APP经BACE1等裂解产生的Aβ异常增加是形成SP的主要原因[4]。动物研究表明：敲除BACE1基因后，Aβ产生显著减少，在抑制BACE1的表达时，AD模型动物的认知功能障碍明显得到改善[5-6]。

正常情况下，大量APP代谢主要通过α途径，不产生Aβ；少量APP经β途径，由β-分泌酶（BACE1）裂解APP，生成可溶性片段sAPPβ和含膜成分的C99，再经γ-分泌酶裂解C99产生Aβ[7-8]。在病理状态下，APP代谢主要经过β途径，产生大量的Aβ，导致AD发生。因此，BACE1是Aβ的生成是限速酶，在AD发病机制中处于核心地位，通过抑制BACE1的表达来调节Aβ的代谢，是治疗AD的一种有效策略[9]。

在本实验中，我们发现姜黄素能降低AD大鼠血清及海马组织中Aβ水平，在抑制海马中β-APP蛋白和基因表达同时，也使BACE1mRNA水平明显降低。因此我们推测：姜黄素可通过对BACE1mRNA调控作用，阻断β-APP裂解进程，抑制Aβ在脑内生成与沉积，从而减少Aβ对神经元毒性作用。

参考文献：

[1]Ono K，Naiki H，YamadaM，et al.The devolepment of preventives and therapeutics for Alzheimer′s disease that inhibite the for mation of beta-amyloid fibrils（fAbeta），as well as destabize preformed fAbta[J].Curr Pham Des，2006，12（33）：4357-4375.

[2]尹红蕾，秦新月，王运良，等.姜黄素对海马内注射Aβ1-40后大鼠认知功能障碍的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2009，12（9）：6-8.

[3]诸葛启钏，大鼠脑立体定位图谱[M].版.北京：人民卫生出版社，2005.

[4]Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer's disease[J].Lancet，2006，368：387-403.

[5]Ohno M，Sametsky EA，Younkin LH et al.BACE1 deficiency rescues memorydeficits and cholinergic dysfunction in a mouse model of Alzheimer's disease[J].Neuron，2004，41：27-33.

[6]Chiocco MJ，Lamb BT.Spatial and temporal control of age-related APP processingin genomic-based beta-secretase transgenic mice[J].Neurobiol Aging，2007，28：75-84.

[7]Müller T，Meyer H E，Egensperger R，et al.The amyloid precursor proteinintracellular domain（AICD）as modulator of gene expression，apoptosis，andcytoskeletaldynamics-Relevance for Alzheimer's disease[J].Prog Neurobiol，2008，85：393-406.

[8]Volbracht C，Penzkofer S，Mansson D，et al.Measurement of cellular b-site of APPcleaving enzyme 1 activity and its modulation in neuronal assay systems[J].AnalBiochem，2009，387：208-220.

[9]Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease：progress andproblems on the road to therapeutics[J].Science，2002，297：353-356.编辑/王敏