miR-187在肺癌组织中的表达及其效应

孙德彬，蓝秀

（丽水市中心医院　呼吸内科，浙江　丽水　323000）



miR-187在肺癌组织中的表达及其效应

孙德彬，蓝秀

（丽水市中心医院呼吸内科，浙江丽水323000）

［摘 要］目的：探讨微小RNA（microRNA，miR）-187在肺癌组织中的表达及其效应。方法：以U6为内参，采用茎环实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测32例肺癌及其癌旁正常组织标本miR-187的表达量，并分析其表达与肺癌临床病理特征间的关系。采用miR-187模拟物（mimics）上调A549肺癌细胞内miR-187表达水平，通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞活性，通过流式细胞术检测细胞周期。结果：与癌旁正常组织比较，miR-187在肺癌组织中表达显著下调（t=5.236，P＜0.001）。临床病理特征相关性分析结果显示，肿瘤组织miR-187的表达与肺癌病理分级及临床分期相关（P＜0.05），与年龄、性别、吸烟史、肿块大小、病理类型及淋巴结转移情况未见明显相关性（P＞0.05）。采用miR-187 mimics上调A549肺癌细胞内miR-187表达后，细胞增殖明显受到抑制，G0/G1期细胞比例增高，G2/M期细胞比例明显降低。结论：miR-187在肺癌组织中的下调表达可能参与了肺癌的发生发展过程。

［关键词］微小RNA；miR-187；肺肿瘤

肺癌的发病率与病死率在全世界范围内增速迅猛［1］，我国目前肺癌病死率为30.61/10万人，较30年前增加了465%，位居各种恶性肿瘤之首［2］。在后基因组时代，RNA组学研究逐渐成为热点：基因组超过98%的转录产物为不编码蛋白的非编码RNA （non-coding RNA，ncRNA），其中微小RNA（microRNA，miR）可通过与靶mRNA的3’-UTR互补配对，指导mRNA切割、降解；也可通过与靶mRNA的不完全配对，沉默其表达，从而参与调控细胞的分化、生长、增殖和凋亡等［3-6］。近年来少数的研究已经证实，miR-187异常表达与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等相关，但其与肺癌的相关性迄今尚鲜见报道。为此，本研究进一步通过茎环实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法对32例肺癌组织及相对应的正常组织进行表达水平检测，旨在分析miR-187表达与肺癌临床病理特征的关系，并通过细胞干预实验验证miR-187的效应。

1　材料和方法

1.1材料 Trizol试剂、胎牛血清、lipofectamine 2000、Opti-MEM培养液、0.05% Trypsin购自美国Invitrogen公司；F12K培养基购自美国Sigma公司；DNase I、RNase-free试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；ReverTra Ace® qPCR RT Kit、SYBR® Green Realtime PCR Master Mix等购自日本Toyobo公司；miR-187模拟物（mimics）及无关序列对照购自上海吉玛公司；A549人非小细胞肺癌细胞购自中科院上海科学研究所细胞库；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2方法

1.2.1组织标本采集及处理：标本取自2008年6 月-2012年7月间在我院胸外科行手术治疗的肺癌患者32例，术前均未行放、化疗等治疗，年龄32～78岁，平均（45.5±12.3）岁，组织病理类型的判断标准参照WHO肺癌的病理学分类。每例标本留取肿瘤组织及对应的正常肺组织（肿瘤远端5 cm处的肺组织，并经组织病理切片检测证实），离体后10 min内置于液氮保存待做后续分析。

1.2.2小RNA抽提：取液氮保存的肺癌组织及癌旁正常组织标本，在液氮中碾碎至粉状，按Trizol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理水溶解。为去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNase I说明书步骤进一步纯化。采用NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）检测RNA溶液OD260/OD280吸光值，计算RNA浓度和纯度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于检测。1.0%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.3miR-187表达检测：以U6作为内参，分析肺癌组织miR-187表达，相关分析的引物序列见表1。0.5 μg总RNA分别以U6 RT引物和miR-187茎环RT引物进行反转录。反转录体系按照ReverTra Ace® qPCR RT Kit说明书进行，反应条件为：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。以20 μL反应体系进行RT-qPCR。测反应体系包括：1 μL RT产物，1×SYBR Green I Master mix，10 μmol/L特异前向引物、10 μmol/L特异反向引物。RT-qPCR条件为：95 ℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃30 s，40个循环。所有样品做3复孔。RT-qPCR使用ABI StepOne/StepOnePlus RT-qPCR仪器进行检测。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以U6作为内参照，以2-ΔΔCt表示miR-187在肺癌组织相对于癌旁组织的表达。ΔCt为同一样本目的基因与内参基因Ct值之差，即ΔCt=CtmiR-187-CtU6，△△Ct=（CtmiR-187-CtU6）肿瘤-（CtmiR-187-CtU6）正常。miR-187相对表达水平＜1，表示肺癌组织miR-187的表达水平低于配对癌旁组织miR-187的表达；miR-187相对表达水平＞1，表示肺癌组织miR-187的表达水平高于配对癌旁组织miR-187的表达。PCR产物经3.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

表1　定量PCR检测相关引物序列

1.2.4细胞培养及miR-187转染：A549人非小细胞肺癌细胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 μg/mL链霉素的F12K培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养，23 d传代一次。设20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L 3个不同浓度的miR-187 mimics干预组、无关序列组（NC组）及未转染组（Blank组）。转染前将2×105个细胞分别接种于6孔板，培养24 h，使细胞贴壁率大约为60%～70%，将培养基替换为无血清Opti-mem培养基，按li-pofetmaine2000说明书转染细胞，转染24 h、48 h及72 h后去培养基，Hanks洗涤3次，加Trizol试剂收集细胞RNA，于80℃冰箱保存。

1.2.5细胞增殖与活性检测：本次实验设A549细胞Blank组、NC组和miR-187 mimics组（miR-187 mimics转染浓度分别为20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L）。另设背景组（未接种细胞，只加入培养基）作为调零孔。实验共分6个组，每组3个复孔。参照CCK-8试剂盒说明书，分别检测上述各组细胞增殖情况。用酶标仪测定450 nm波长的吸光度值（OD）。并计算细胞活力=（实验组-空白孔）A450/（对照组-空白孔）A450×100%。实验重复3次。

1.2.6流式细胞仪检测细胞周期：以2×105个细胞接种于6孔板，每孔2 mL，转染前用无血清培养液饥饿培养24 h，使得细胞周期同步在G0/G1期。取miR-187 mimics干预组及无NC组转染的细胞，0.25%胰酶消化，用培养液吹打，800×g离心15 min去上清，PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹匀，用5 mL注射器将细胞吸起，打入5 mL 70%（预冷）乙醇中，4 ℃固定过夜，800×g离心15 min收集固定细胞，PBS 洗2次，用0.4 mL PBS重悬细胞并轻轻吹打，加适当浓度的RNase-A，37 ℃水浴消化30 min，加入适当浓度的PI，在冰浴中避光染色30 min，过滤，流式细胞仪（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）分析检测，每个样本取3个复孔，每个复孔检测1次，获得数据后进行结果分析。

1.3统计学处理方法 采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。miR-187表达数据以中位数和四分位数间距表示。正态分布且方差齐的数据2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，肺癌组织与其配对癌旁组织miR-187平均表达水平比较采用配对的非参数Wilcoxon符号秩检验；肺癌组织miR-187相对表达水平与胃癌临床病理指标之间的关系采Mann-Whitney u检验（2组）和Kruskal-Wallis H检验（多组）进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-187检测特异性分析 qPCR扩增产物的熔解曲线（见图1A）显示为单峰，肺癌组织和癌旁正常组织总RNA经特异引物RT-qPCR扩增后， miR-187 及U6内参的PCR产物为单一条带（见图1B），说明建立的RT-qPCR方法能特异检测相应的目的基因。

图1　miR-187和内参U6 qPCR特异性分析

图2　肺癌组织及其配对癌旁正常肺组织miR-187平均表达水平

2.2肺癌组织miR-187表达水平 31例肺癌组织及其配对癌旁正常肺组织miR-187表达水平的RT-qPCR检测结果（见图2）表明，肺癌组织miR-187表达水平明显低于配对癌旁正常肺组织（t=5.236，P＜0.001），肺癌组织miR-187相对表达水平为0.626 （0.283，0.827）。

2.3miR-187表达水平与肺癌临床病理特征的关系 miR-187的表达在不同病理分级及临床分期存在显著差异（见表2）。不同病理分级的肺癌标本中，分化程度越低的肺癌组织miR-187表达水平越低（P=0.017），miR-187表达水平在III/IV期临床分期的肺癌组织标本明显低于I/II期的组织标本（P= 0.026）。miR-187表达水平和年龄、性别、吸烟史、肿块大小、病理类型及淋巴结转移情况未见明显相关性（P＞0.05）。见表2。

表2　miR-187表达水平与肿癌临床病理特征的关系

2.4上调miR-187表达对A549人非小细胞肺癌细胞增殖及细胞周期的影响 结果（见图3）显示，与Blank组和NC组比较，20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L miR-187 mimics转染各实验组的A549细胞增殖均明显受到抑制，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。miR-187 mimics转染24 h、48 h和72 h等不同的时间点之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。细胞周期检测结果（见图4）显示，与Blank组和NC组比较，miR-187 mimics各浓度组转染的A549细胞周期分布在24 h、48 h和72 h均发生改变，G0/G1期细胞比例增高，G2/M期细胞比例明显降低（P＜0.05），但未见明显的时间效应和浓度效应。

图3　miR-187 mimics干预对A549细胞活力的影响

3　讨论

miRNA是近年来在多种真核细胞和病毒中发现的一类非编码蛋白的短序列（21～23个核苷酸）RNA片断。它通常与靶基因的3’UTR区互补配对，指导miRNA复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制，抑制基因表达［7-9］。自从Calin等［8］首次报道miRNA异常表达与肿瘤有关，近十几年来，miRNA在肿瘤的发生发展中的作用越来越受到重视。

越来越多的证据表明，miR-187可作为抑癌基因或致癌基因，与肿瘤细胞增殖和凋亡密切相关。鼻咽癌［9］、肾癌［10］、胰腺癌［11］、甲状腺癌［12］、食管癌［13］以及神经母细胞瘤［14］等多种肿瘤，已证实存在miR-187异常表达。我们前期肺癌组织miRNA芯片检测发现，miR-187在肺癌组织表达明显下调表达。为验证miR-187表达水平与肺癌的相关性，本研究以U6为内参照，采用RT-qPCR检测了32例肺癌组织miR-187的表达。结果显示，与癌旁正常肺组织比较，肺癌组织miR-187的表达明显下调。临床病理特征相关性分析显示，miR-187的表达水平与肺癌病理分级及临床分期相关。进一步细胞干预实验证实，采用miR-187 mimics转染上调细胞内miR-187表达后，细胞增殖明显受到抑制，G0/G1期细胞比例增高，G2/M期细胞比例明显降低。这些结果提示肿瘤组织低表达的miR-187可能参与肺癌的发生发展过程。最近有研究［15］显示，miR-187通过调节靶基因DAB2，参与了卵巢癌的进展，也与患者的总体生存率及术后无复发生存率相关。Mulrane等［16］发现，乳腺癌组织miR-187表达水平的高、低与乳腺癌的侵袭能力相关，可以作为一个独立的预后因素。但是不同研究者报道亦不尽相同，Cheng等［17］报道，反义抑制miR-187的表达，HeLa细胞的增殖能力下降。而Park等［18］的研究认为miR-187的过量表达，HeLa细胞的增殖能力减退，细胞凋亡增加。这些结果提示，miR-187在不同肿瘤组织可能以不同方式参与肿瘤致癌过程。

图4　miR-187 mimics干预48 h对A549细胞周期的影响

miRNA主要通过调节靶基因表达发挥效应。Dab2［15］、MMP13［16］已被证实是miR-187的靶基因。Sirotkin等［19］研究发现miR-187的过度表达可以减少人类卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白质BAX和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达。最近Helwak等［20］基于miRNA-mRNA直接相互作用的CLASH实验发现，TUBG1、MAD2L2及STOML2是miR-187的靶基因。已经证实，MAD2L2是一个参与有丝分裂检查点过程控制的成员的基因，与癌旁正常组织比较，结肠癌组织表达明显上调，而且MAD2L2上调表达的结直肠癌患者不良预后［21］。STOML2是Stomatin超家族成员之一，也已经证实在多种肿瘤组织上调表达［22-25］。由于miR-187在不同类型肿瘤中的作用不同，肺癌肿瘤组下调表达的miR-187是否通过上述的靶基因发挥效应还有待于进一步验证。

参考文献：

［1］ JEMAL A， BRAY F， CENTER M M， et al. Global cancer statistics［J］. CA Cancer J Clin， 2011， 61（2）︰ 69-90.

［2］ ZHAO P， DAI M， CHEN W， et al. Cancer trends in China［J］. Jpn J Clin Oncol， 2010， 40︰ 281-285.

［3］ Li S， Gao M， Li Z， et al. Role of microRNAs in metastasis of non-small cell lung cancer［J］. Front Biosci （Landmark Ed）， 2016（1）， 21︰ 1.

［4］ ANGULO M， LECUONA E， SZNAJDER J I. Role of microRNAs in lung disease［J］. Arch Bronconeumol， 2012， 48 （9）︰ 325-330.

［5］ Ha T Y. MicroRNAs in human diseases︰ from lung， liver and kidney diseases to infectious disease， sickle cell disease and endometrium disease［J］. Immune Netw， 2011， 11（6）︰ 309-323.

［6］ OGLESBY I K， MCELVANEY N G， GREENE C M. MicroRNAs in infl ammatory lung disease—master regulators or target practice?［J］. Respir Res， 2010， 11︰ 148.

［7］ ZAMORE P D， HALEY B. Ribo-gnome︰ the big world of small RNAs［J］. Science， 2005， 309（2）︰ 1519-1524.

［8］ CALIN G A， DUMITRU C D， SHIMIZU M， et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2002， 99（24）︰ 15524-15529.

［9］ CHEN H， CHEN G， CHEN Y， et al. MicroRNA deregulation and pathway alterations in nasopharyngeal carcinoma［J］. Br J Cancer， 2009， 100︰ 1002-1011.

［10］ FRIDMAN E， DOTAN Z， BARSHACK I， et al. Accurate molecular classification of renal tumors using microRNA expression［J］. J Mol Diagn， 2010， 12（5）︰ 687-696.

［11］ BLOOMSTON M， FRANKEL W L， PETROCCA F， et al. MicroRNA expression patterns to differentiate pancreatic adenocarcinoma from normal pancreas and chronic pancreatitis［J］. JAMA， 2007， 297︰ 1901-1908.

［12］ NIKIFOROVA M N， TSENG G C， STEWARD D， et al. Mi-croRNA expression profi ling of thyroid tumors︰ biological significance and diagnostic utility［J］. J Clin Endocrinol Metab， 2008， 93（5）︰ 1600-1608.

［13］ WIJNHOVEN B， HUSSEY D J， WATSON D I， et al. MicroRNA profi ling of Barrett’s oesophagus and oesophageal adenocarcinoma［J］. Br J Surg， 2010， 97︰ 853-861.

［14］ CHEN Y， STALLINGS R L. Differential patterns of microRNA expression in neuroblastoma are correlated with prognosis， differentiation， and apoptosis［J］. Cancer Res， 2007，67（3）︰ 976-983.

［15］ CHAO A， LIN C， LEE Y， et al. Regulation of ovarian cancer progression by microRNA-187 through targeting Disabled homolog-2［J］. Oncogene， 2011， 31（6）︰ 764-775.

［16］ MULRANE L， MADDEN S F， BRENNAN D J， et al. miR-187 is an independent prognostic factor in breast cancer and confers increased invasive potential in vitro［J］. Clin Cancer Res， 2012， 18（24）︰ 6702-6713.

［17］ CHENG A M， BYROM M W， SHELTON J， et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis［J］. Nucleic Acids Res， 2005， 33（4）︰ 1290-1297.

［18］ PARK S Y， LEE J H， HA M， et al. miR-29 miRNAs activate p53 by targeting p85α and CDC42［J］. Nat Struct Mol Biol，2008， 16（1）︰ 23-29.

［19］ SIROTKIN A V， LAUKOVÁ M， OVCHARENKO D， et al. Identifi cation of microRNAs controlling human ovarian cell proliferation and apoptosis［J］. J Cell Physiol， 2010， 223︰ 49-56.

［20］ HELWAK A， KUDLA G， DUDNAKOVA T， et al. Mapping the human miRNA interactome by CLASH reveals frequent noncanonical binding［J］. Cell， 2013， 153（3）︰ 654-665.

［21］ RIMKUS C， FRIEDERICHS J， ROSENBERG R， et al. Expression of the mitotic checkpoint gene MAD2L2 has prognostic significance in colon cancer［J］. Int J Cancer， 2007，120（1）︰ 207-211.

［22］ CAO W， ZHANG B， LIU Y， et al. High-level SLP-2 expression and HER-2/neu protein expression are associated with decreased breast cancer patient survival［J］. Am J Clin Pathol，2007， 128（3）︰ 430-436.

［23］ CAO W F， ZHANG L Y， LIU M B， et al. Prognostic signifi -cance of stomatin-like protein 2 overexpression in laryngeal squamous cell carcinoma︰ clinical， histologic， and immunohistochemistry analyses with tissue microarray［J］. Hum Pathol， 2007， 38（5）︰ 747-752.

［24］ WANG Y， CAO W， YU Z， et al. Downregulation of a mitochondria associated protein SLP-2 inhibits tumor cell motility， proliferation and enhances cell sensitivity to chemotherapeutic reagents［J］. Cancer Biol Ther， 2009， 8（17）︰1651-1658.

［25］ ZHANG L， DING F， CAO W， et al. Stomatin-like protein 2 is overexpressed in cancer and involved in regulating cell growth and cell adhesion in human esophageal squamous cell carcinoma［J］. Clin Cancer Res， 2006， 12（5）︰ 1639-1646.

（本文编辑：胡苗苗）

Expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect

SUN Debin， LAN Xiu. Department of Respiratory Medicine， Lishui Central Hospital， Lishui， 323000

Abstract：Objective： To explore the expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect. Methods： By normalized to U6， the expressions of miR-187 in 32 lung cancer and matched non-tumor adjacent tissue specimens were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-187 expression and clinicopathological characteristics was further analyzed. After transfected with miR-187 mimics， the biological functions of miR-187 were determined by cell proliferation and cell cycle assay. Results：Expression of miR-187 in the tissue of lung cancer was obviously higher than that in non-tumor adjacent tissue specimens （t=5.236， P＜0.0001）. Clinical features correlation analysis showed that the down-expression of miR-187 was correlated with the pathological grading and the clinical staging （P＜0.05）. Functional studies indicated that the overexpression of miR-187 dramatically inhibited the proliferation of A549 cells in vitro and changed the situation of the cell cycle， arrested at G0/G1 phase. Conclusion： Down-expression of miR-187 in the patients of lung cancer may play a key role in the development and progression of lung cancer.

Key words：microRNA； miR-187； lung neoplasms

［中图分类号］R734.2

［文献标志码］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.010

收稿日期：2015-08-19

作者简介：孙德彬（1975-），男，浙江青田人，副主任医师。