凝血酶原基因rs5896位点C＞T多态性与肾结石的相关性

季慧娟，陈陶，江明华，王大文，王怡君，胡云良

（温州医科大学附属第二医院，浙江　温州　325027，1.检验科；2.泌尿外科）



凝血酶原基因rs5896位点C＞T多态性与肾结石的相关性

季慧娟1，陈陶1，江明华1，王大文2，王怡君2，胡云良1

（温州医科大学附属第二医院，浙江温州325027，1.检验科；2.泌尿外科）

［摘 要］目的：探讨凝血酶原基因rs5896位点C＞T多态性与浙南地区人群肾结石的相关性。方法：采用PCR-RFLP和测序技术分析102例肾结石患者（病例组）和年龄相匹配的95例健康人群（对照组）凝血酶原基因rs5896位点，比较此位点2组间基因型频率和等位基因频率差异。结果：凝血酶原基因rs5896位点CC、CT和TT基因型频率在病例组为13.7%、50.9%和35.4%，对照组为24.2%、51.6%和24.2%，2组比较差异有统计学意义（P=0.028）；等位基因C、T频率在病例组和对照组分别为39.2%、60.8%和50.0%、50.0%，差异有统计学意义（P=0.031）。结论：凝血酶原基因rs5896位点多态性与浙南地区人群患肾结石具有关联性，rs5896位点C＞T变异可能是肾结石的易感因素。

［关键词］多态性；凝血酶原基因；肾结石

我国泌尿系结石发病率为1%～5%，复发率高达50%左右，发病率存在地区差异［1］。肾结石成因复杂，往往包含多种致病因素，主要由感染性因素、代谢性因素、遗传性因素等造成。本研究通过分析浙南地区人群凝血酶原基因rs5896位点多态性与肾结石的相关性，来了解凝血酶原基因rs5896位点多态性是否对浙南地区人群肾结石的发病率有影响。

1　材料和方法

1.1一般资料 依据《欧洲泌尿外科学会2006年泌尿系结石诊治指南》，收集2014年9月至2015年8月在温州医科大学附属第二医院入院的肾结石病例102例。其中男55例，女47例，年龄18～80岁，平均（53.50±13.73）岁。选择年龄、性别相匹配的健康体检者95例作为对照组，其中男51例，女44例，年龄18～86岁，平均（59.19±17.41）岁。

1.2基因组DNA提取 收集以乙二胺四乙酸钾（EDTA-K2）抗凝的血液2 mL，-20 ℃保存。采用人类基因组DNA提取试剂盒（RelaxGene Blood DNA System，TIANGEN）提取全血基因组DNA（严格按说明书操作），-20 ℃留存。

1.3引物设计与合成 根据GeneBank NG_008953序列，采用Primer Premier 5.0分析软件设计rs5896位点引物，上游引物（5’-3’）：CTCAGGGCCTTGGCCTG TGCGC，下游引物（5’-3’）：CTTGTGAGACAGCGAGGACG CC，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.4聚合酶链反应（PCR）扩增及基因型检测 体系总体积为30 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，10×loading buffer 3 μL，dNTP 2 μL，taq 酶0.2 μL（购自Takara公司），ddH2O 21.8 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；30个循环后72 ℃延伸10 min。扩增出大小为550 bp的DNA目的片段。然后采用特异性限制性内切酶Ncol（Fermentas，ER0571）依据说明书反应条件进行酶切：ddH2O 7 μL，10×buffer tango 2 μL，DNA（0.5～1 μg）10 μL，Ncol 0.5 μL，取酶切后产物6 μL经5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并将PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，所用测序仪器为ABIPRISM3720。

1.5氨基酸序列同源分析 使用ClustalW软件（http︰//www.ebi.ac.uk/clustalw/）对来源于NCBI数据库的蛋白序列进行同源比对。

1.6统计学处理方法 各基因型、基因频率在病例组和对照组人群分布差异采用chi-square检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1电泳图 含凝血酶原基因rs5896位点经上述引物扩增的目的片段为550 bp，利用Ncol酶对该片段的限制性酶切位点的识别不同，550 bp大小的目的片段可被切割成不同的小片段（见图1）。

2.2测序图谱 凝血酶原rs5896位点的多态性可表示为CC、CT和TT基因型（见图2）。

2.3Hardy-Weinberg遗传平衡分析 凝血酶原基因rs5896位点各基因型（CC、CT和TT）分布符合Hardy-Weinberg定律（P＞0.05）（见表1），标本具有群体代表性。

2.4基因型和等位基因频率比较 凝血酶原基因rs5896位点CC、CT、TT基因型频率在病例组和对照组分别为13.7%、50.9%、35.4%和24.2%、51.6%、 24.2%，差异有统计学意义（P=0.028）（见表2）；等位基因C频率在病例组为39.2%，等位基因T在病例组分布频率为60.8%，与对照组比差异有统计学意义（P=0.031）（见表3）。病例组TT基因型易感性OR值是对照组CC基因型的2.57倍（P=0.027，95%CI：1.104～5.990）。

图1　凝血酶原基因rs5896位点的PCR-RFLP电泳分析结果

图2　凝血酶原基因rs5896位点测序结果

表1　凝血酶原基因rs5896位点基因型遗传平衡性检验

表2　不同组别间rs5896位点多态性基因型的比较　［n（%）］

表3　不同组别rs5896位点的C、T等位基因频率的比较（%）

图3　凝血酶原165位氨基酸序列的保守性分析

2.5保守性分析结果 蛋白序列同源比对发现，凝血酶原基因rs5896位点所编码的氨基酸，在其他几种维生素K依赖的凝血因子蛋白中高度保守；同时在不同物种间凝血酶原也具备高度的保守性（见图3）。

3　讨论

肾结石具有区域流行性的特征，是南方人群中常见的疾病，不仅给患者带来痛苦，也给社会医疗增加了巨大的经济负担。肾结石是由遗传易感性和环境因素共同作用的疾病。有文献报道，骨桥素蛋白、维生素D受体、钙敏感受体等基因异常都与结石具有一定关联性。虽然临床利用B超引导方式治疗肾结石方法较为成熟［2］，但能尽早预防肾结石的发生发展和肾结石的再次复发更有利于减轻患者的痛苦。目前肾结石发病机制仍未明，而具体的致病机制有待于进一步研究［3］。大多数泌尿系结石与钙盐代谢相关［4］，据报道凝血酶原结构异常与含钙结石具有一定的相关性［5］，影响肾结石的成核、聚集和结晶的形成。凝血酶原主要由肝脏细胞合成和分泌，近年来在肾脏中也有表达。凝血酶原相对分子质量（MW）为71 600，糖含量为8.2%，是由579个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，分4个功能域区：1个γ羧基谷氨酸区（Gla）、2个环状区（K1、K2）和1个催化区，其编码基因定位于11p11-q12，由14个外显子与13个内含子组成，长约21 kb，其mRNA总长度约为2.1 kb。2个环状功能区域由外显子4～7编码，K1、K2各含有约80个氨基酸，两者均借助于二硫键分别形成三环状结构。凝血酶原经过内或外源凝血途径激活，释放出凝血酶原分子氨基末端的片段1+2（含分子的Gla区和2个K区）。尿凝血酶原片段1（urinary prothrombin fragment 1，UPTF1）是人类凝血酶原激活后的裂解片段，分子量31 kD，属糖蛋白，可作为草酸钙结石的抑制蛋白［6］；氨基酸序列分析发现在该蛋白近N-终末端含Gla残基，是该蛋白的钙离子结合部位，在人体未稀释的尿液中或无机环境下，它是含钙结石晶体发生发展的抑制蛋白［7］。

凝血酶原基因rs5896位点位于编码区的第6外显子，相应编码的氨基酸在凝血酶原K1区内，而K1区被认为在机体凝血过程中参与凝血酶（原）与其底物及辅因子的相互作用中扮演重要的角色［8-9］。通过蛋白序列进行同源比对，发现凝血酶原基因rs5896位点编码的165位氨基酸在其他几种维生素K依赖的凝血酶原中高度保守；同时在不同物种间凝血酶原该位点同样具备高度的保守性，推测该165位的氨基酸残基与凝血酶原功能的特异性密切相关（见图3）。凝血酶原基因rs5896位点上C＞T的基因突变可导致UPTF1片段165位氨基酸由极性不带电荷的苏氨酸被非极性的甲硫氨酸替代，由于165位的甲硫氨酸不能与180位的谷氨酸形成正常情况下的氢键，可引起蛋白质的空间构象改变［10］。进而也影响着UPTF1片段的糖基化及唾液酸化，UPTF1的糖基化可控制草酸钙晶体的成核和聚集而唾液酸化在抑制草酸钙结石晶体的形成过程中起关键作用［11-12］。

我们通过对浙南地区102例肾结石患者和95例健康人群凝血酶原基因rs5896位点的多态性研究发现，病例组TT基因型易感性是对照组CC基因型的2.57倍（P=0.027，95%CI：1.104～5.990），差异有统计学意义。等位基因C频率在病例组低于对照组，差异有统计学意义。本研究结果提示，凝血酶原基因rs5896位点的C等位基因编码的苏氨酸可能是肾结石的保护基因，该位点的C＞T变异导致的165位的苏氨酸被甲硫氨基酸替代，可减少UPTF1的糖基化和唾液酸化，从而影响UPTF1对草酸钙晶体形成的抑制活性。然而关于UPTF1致使肾结石形成的确切机制有待于进一步阐明。由于本研究样本量较少可能会带来误差，需要今后进一步扩大样本量来研究验证。

参考文献：

［1］ 叶章群. 泌尿系结石研究现况与展望［J］. 中华实验外科杂志， 2005， 22（3）︰ 261-262.

［2］ 赵益华， 蒋旭敏， 黄伟， 等. B超引导“改良一步法”建立标准通道在经皮肾镜碎石术中的应用［J］. 温州医科大学学报， 2014， 44（12）︰ 913-916.

［3］ VEZZOLI G， TERRANEGRA A， ARCIDIACONO T， et al. Genetics and calcium nephrolithiasis［J］. Kidney Int， 2011，80︰ 587-593.

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［5］ RUNGROJ N， SRITIPPAYAWAN S， THONGNOPPAKHUN W， et al. Prothrombin haplotype associated with kidney stone disease in Northeastern Thai patients［J］. Urology，2011， 77︰ 249. e17-23.

［6］ DOYLE I R， RYALL R L， MARSHALL V R. Inclusion of proteins into calcium oxalate crystals precipitated from human urine︰ a highly selective phenomenon［J］. Clin Chem， 1991， 37︰ 1589-1594.

［7］ RYALL R L， GROVER P K， STAPLETON A M， et al. The urinary F1 activation peptide of human prothrombin is a potent inhibitor of calcium oxalate crystallization in undiluted human urine in vitro［J］. Clin Sci （Lond）， 1995， 89︰ 533-541.

［8］ ATKINSON R A， WILLIAMS R J. Solution structure of the kringle 4 domain from human plasminogen by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy and distance geometry［J］. J Mol Biol， 1990， 212︰ 541-552.

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［10］ RUNGROJ N， SUDTACHAT N， NETTUWAKUL C， et al. Association between human prothrombin variant （T165M）and kidney stone disease［J］. PLoS One， 2012， 7︰ e45533.

［11］ WEBBER D， RODGERS A L， STURROCK E D. Glycosylation of prothrombin fragment 1 governs calcium oxalate crystal nucleation and aggregation， but not crystal growth［J］. Urol Res， 2007， 35︰ 277-285.

［12］ WEBBER D， RADCLIFFE C M， ROYLE L， et al. Sialylation of urinary prothrombin fragment 1 is implicated as a contributory factor in the risk of calcium oxalate kidney stone formation［J］. FEBS J， 2006， 273︰ 3024-3037.

（本文编辑：吴昔昔）

Correlation between prothrombin gene polymorphism of rs5896 C＞T and kidney stone

JI Huijuan1，CHEN Tao1， JIANG Minghua1， WANG Dawen2， WANG Yijun2， HU Yunliang1. 1.Department of Clinical Laboratory， the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Department of Urinary Surgery， the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Abstract：Objective： To investigate the correlation between prothrombin rs5896 C＞T genetic polymorphism and kidney stone in the southern population of Zhejiang. Methods： Prothrombin gene polymorphism rs5896 was investigated in 102 patients with renal stone formation and 95 age-matched healthy volunteers without history of renal stone formation， using polymerase chain reaction-restriction fragment polymorphism （PCR-RFLP） and sequencing. The frequences of genetype and allele gene in the case and control were analyzed. Results： The frequencies of CC， CT， TT were 13.7%， 50.9%， 35.4% and 24.2%， 51.6%， 24.2% in kidney stone patients and healthy controls respectively. The difference between case and control was slight signifi cance （P=0.028）. The frequencies of C and T were 39.2%， 60.8% and 50.0%， 50.0% in kidney stone patients and heathy control. There was a different signifi cance （P=0.031）. Conclusion： It suggests that the rs5896 polymorphism of prothrombin gene is associated with the kidney stone in the southern population of Zhejiang， and it is possible that rs5896 C＞T acts as a risk factor for the development of renal stone disease.

Key words：polymorphism； prothrombin gene； kidney stone

［中图分类号］R394.3

［文献标志码］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.002

收稿日期：2015-10-26

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（2012 3321120002）；浙江省教育厅科研基金资助项目（Y201223619）。

作者简介：季慧娟（1989-），女，江西抚州人，硕士生。

通信作者：胡云良，教授，Email：hyl@wmu.edu.cn。