miR-21在川崎病急性期患者血清中的表达及其临床意义

贾连红，潘璐璐，卢家程，耿志敏，吴蓉洲，褚茂平

（1.温州医科大学附属第一医院　儿童中心，浙江　温州　325015；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院　儿童心脏中心，温州医科大学心脏发育与转化医学研究所，浙江　温州　325027）



miR-21在川崎病急性期患者血清中的表达及其临床意义

贾连红1，潘璐璐2，卢家程1，耿志敏1，吴蓉洲2，褚茂平2

（1.温州医科大学附属第一医院儿童中心，浙江温州325015；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿童心脏中心，温州医科大学心脏发育与转化医学研究所，浙江温州325027）

［摘 要］目的：探讨micrRNA-21（miR-21）在川崎病（KD）患者血清中的表达及其临床意义。方法：收集温州医科大学附属第二医院育英儿童医院2014年1月-2015年6月收治的33例KD患者以及15例健康体检者的血清标本，以 cel-miR-39为外参基因，通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测血清miR-21的表达，并通过受试者工作特征（ROC）曲线评估其作为KD疾病标记物的诊断价值。结果：miR-21在KD急性期患儿血清中表达水平明显高于健康儿童血清（P＜0.05），恢复期则降低至正常水平。ROC曲线显示，以miR-21诊断KD的曲线下面积（AUC）为0.736（95%CI：0.531～0.941），当临界值（诊断阈值）取1.09时，其诊断灵敏度和特异度分别为0.846和0.714。血清miR-21表达与KD临床特征相关分析显示，高血小板水平血清中miR-21表达更高。结论：KD患者血清miR-21水平显著升高，可能是KD诊断的潜在血清标志物之一。

［关键词］川崎病；microRNA-21；疾病诊断

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种主要发生在5岁以下婴幼儿的急性发热出疹性疾病，其主要病理改变为全身非特异性血管炎，其中冠状动脉损害（coronary artery lesion，CAL）是KD严重并发症，已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要病因［1-2］。由于KD的病因未明、发病机制不清，因此早期诊断并规范治疗对降低KD冠状动脉并发症极为重要。然而，目前临床上对KD的诊断主要依靠临床表现［3-4］，缺乏特异性的检验指标。研究发现，血清中游离存在的miRNA是多种疾病新的生物标志。为此本研究选择与多种心血管疾病的发生及发展密切相关的microRNA-21（miR-21），测定其在KD急性期血清中的表达水平，探讨miR-21在KD诊断中的临床价值。

1　资料和方法

1.1一般资料 选择温州医科大学附属第二医院育英儿童医院2014年1月-2015年6月确诊并收治的KD患儿33例，诊断依据美国儿童心脏协会制定的标准［5］，其中男25例，女8例，年龄均为5岁以下，平均（25.6±18.6）月，经超声心动图检测，存在冠状动脉扩张或动脉瘤病变，即CAL（+）13例，无冠状动脉病变，即CAL（-）20例；KD恢复期组儿童均为急性期治疗后儿童，共15例，其中男11例，女4例，平均年龄（21.8±18.7）月。选择同期门诊体检健康儿童15例，其中男11例，女4例，年龄均为5岁以下，平均（20.4±9.9）月，排除肺、肝、肾、脑等重大疾病。各组研究对象的年龄、性别构成差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。临床资料见表1。

表1　3组研究对象临床资料（±s）

表1　3组研究对象临床资料（±s）

D-二聚体（μg/mL）男女性别（n/%）组别　例数　年龄（月）　白细胞（×109/L）血小板（×109/L）谷丙转氨酶（U/L）谷草转氨酶（U/L）健康儿童　15　11/73.3　4/26.7　20.4± 9.9　8.17±2.59　341.5± 71.52　20.58±　9.81　37.35±　6.32　0.39±0.19 KD恢复期　15　11/73.3　4/26.7　21.8±18.7　8.27±2.63　582.31±126.09 60.73± 61.88　63.54± 31.40　0.84±0.66 KD急性期CAL（+）13　10/76.9　3/23.1　26.4±18.1　18.98±9.30 421.50±117.36 70.71± 58.96　50.21± 49.90　1.27±0.97 CAL（-）　20　15/75.0　5/25.0　24.6±19.2　14.86±5.39 395.40±121.40 75.27±115.32 58.47±129.28　1.48±1.16

1.2主要试剂与仪器 Tri-reagent-BD购自美国Sigma公司；miScript II RT Kit、miScript Primer Assay、miScript SYBRGreen PCR Kit购自QIAGEN公司；外参cel-miR-39由上海吉玛公司合成。定量PCR仪器为Bio-Rad的C1000 Touch Thermal Cycler。

1.3RNA提取和miR-21表达检测 所有儿童抽取空腹静脉血2 mL，经3 000 r/min离心10 min分离血清，经12 000 r/min高速离心15 min去除细胞碎片，取上层血清200 μL，加入750 μL Trizol剧烈震荡后加入等量外参，冰上放置15 min后加入200 μL氯仿剧烈震荡30 s，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min后，取上清350 μL于新去RNase的EP管内，加入等量异丙醇-20 ℃过夜后，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，弃上清后加入1 mL 80%乙醇洗涤，离心后加入15 μL DEPC水溶解RNA，利用miScript II RT Kit将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模版，在C1000 Touch Thermal Cycler PCR仪上，利用实时定量PCR（RT-qPCR）对miR-21进行定量检测。按照试剂盒说明书，反应条件为预变性95 ℃ 15 min，95 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，扩增40个循环。所有样品均做3个平行孔，循环数取其均数。以cel-miR-39为外参，miR-21的相对表达量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct外参基因。

1.4统计学处理方法 应用SPSS16.0统计学软件。采用独立样本t检验比较KD患儿与健康儿童血清miR-21表达的差异，采用配对t检验比较KD患儿急性期与恢复期血清miR-21表达的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析和曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）评估血清miRNA作为疾病诊断标记物的价值。

2　结果

2.1miR-21在KD患者血清中表达分析 由于KD血清miRNA定量检测目前尚无适宜的内参基因，为此本研究选用与人无同源性的线虫cel-miR-39作为外参照。结果显示，KD急性期、健康儿童及KD恢复期血清miR-21表达水平分别为3.04±1.76、1.13± 0.89及1.75±1.14，KD急性期患儿血清miR-21表达水平明显高于健康对照儿童（P＜0.05），而疾病恢复期即下降至接近健康儿童水平。

2.2血清miR-21作为KD疾病诊断的评价 利用R软件制作ROC曲线，评价miR-21在KD中的诊断价值。如图1所示，血清miR-21诊断KD的ROC曲线的AUC为0.736（95%CI：0.531～0.941），当临界值（诊断阈值）取1.09时，其灵敏度为0.846，特异度为0.714，具有较好的诊断价值。

2.3血清miR-21表达水平与KD临床特征关系 进一步分析血清miR-21相对表达量与KD患儿临床特征的关系，结果如表2所示，miR-21在血小板计数高于300×109/L的儿童血清中的表达明显高于血小板计数正常儿童的血清（P＜0.05），而在其他实验室指标上差异无统计学意义（P＞0.05）。将33例KD患儿按照有无CAL进行分类，分析发现miR-21表达在有无CAL中差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1　血清miR-21对KD急性期诊断作用的ROC曲线

表2　miR-21与KD临床特征相关性分析（n=33，±s）

表2　miR-21与KD临床特征相关性分析（n=33，±s）

临床特征　miR-21　P白细胞（×109/L）5～12　3.90±2.65　0.297 ＞12　2.26±2.18血小板（×109/L）100～300　0.91±1.21　0.041 ＞300　3.47±2.22谷丙转氨酶（U/L）7～40　2.63±2.11　0.988 ＞40　2.65±2.60谷草转氨酶（U/L）13～35　2.46±1.98　0.776 ＞35　2.84±2.79 D-二聚体（μg/mL）0～0.5　1.02±0.98　0.297 ＞0.5　2.93±2.36 CAL （-）　2.93±7.05　0.839 （+）　2.50±3.44

3　讨论

KD，又称为黏膜皮肤淋巴结综合征，由日本的川崎富首次报道，是一种以全身中小血管炎为主要病变的急性全身出疹性免疫性疾病，主要累及中小动脉，尤其是冠状动脉，虽然医学诊疗技术不断发展，以丙种球蛋白为主的综合治疗方案取得了一定的效果，但仍有部分KD患者诊断不及时，导致并发严重冠状动脉病变。因此及时诊断KD，是预防冠状动脉并发症的最佳手段。

miRNA在心血管中的研究屡见不鲜。Fish等［6］发现，miR-126在血管发育过程中，尤其是在保持血管的完整性和血管生成中发挥调节作用。Mitchell等［7］证实血清中存在丰富而且稳定的miRNA，这些miRNA不易被血清中的RNase降解，而血清标本易于取得，且对患儿的损伤小，其作为生物标记物具有明显优势。血清中miR-29a和miR-92a的表达情况对结直肠癌的早期诊断具有一定价值［8］。而miRNA在KD中的研究报道较少，2013年，Shimizu等［9］首次报道差异表达的miR-145可能通过TGF-β通路参与KD的发生。Yun等［10］通过芯片发现，与健康儿童比较，KD患儿血清中存在特异相关的miRNAs，如miRNA-200c和miRNA-371-5p。Rowley等［11］认为miRNA可能成为KD的潜在生物学标志物。Ni等［12］研究发现，miR-155、miR-21和miR-31能够调控Treg细胞基因的表达从而参与KD的发生。

miR-21在心血管病中的作用备受关注。Zhou等［13］发现，miR-21参与了血管炎症反应的发生。Li等［14］发现，miR-21能够通过靶向AP-1调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移，进而参与血管疾病的发生。另外，miR-21在动脉粥样硬化循环内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）中呈高表达，能够通过TGF-β通路影响EPCs的增殖［15］，动脉粥样硬化斑块中miR-21亦呈高表达状态［16］。有学者发现，miR-21可以通过对肌球蛋白的作用而影响平滑肌的功能［17］，肺动脉平滑肌细胞经过低氧处理后miR-21表达升高［18］。Ji等［19］证实，在损伤的血管中miR-21表达增高，而抑制miR-21表达后，血管损伤程度有所减轻。剪切力是引起血管损伤的常见因素，当剪切力作用于血管内皮细胞后，内皮细胞内miR-21表达量升高［20-21］。由此可见，miR-21在多种心血管疾病中发挥一定作用，有望成为心血管疾病治疗新的靶点。

本课题组前期研究发现，miR-23a在KD急性期血清中表达上调，并且对脐静脉内皮细胞生长及迁移有一定影响［22］，提示miR-23a的异常可能参与KD内皮细胞的损伤过程。本课题组还发现，与健康儿童比较，KD外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的miR-130a和miR-125b存在差异表达，证实miR-130a和miR-125b可能参与了KD的发生与发展，可以作为KD诊断及预后评估的一项新的生物标志物［23］。本研究通过RT-qPCR检测发现，miR-21在KD患者血清中的表达明显升高，将血清miR-21作为KD诊断指标，其灵敏度和特异度均大于70%。但本研究所纳入样本量有限，仍存在偶然误差的可能，其灵敏度和特异度以及临界值的选择还需在大样本量的人群中进一步验证。

参考文献：

［1］ 杜忠东， 梁璐， 孟晓萍， 等. 1995-1999年北京住院小儿川崎病流行病学调查［J］. 中华医学杂志， 2003， 83（21）︰ 38-42.

［2］ 张永兰， 杜忠东， 赵地， 等. 2000-2004年北京川崎病住院患儿流行病学调查［J］. 实用儿科临床杂志， 2007， 22（1）︰ 12-15.

［3］ YIM D， CURTIS N， CHEUNG M， et al. An update on Kawasaki disease II︰ clinical features，diagnosis， treatment and outcomes ［J］. J Paediatr Child Health， 2013， 49（8）︰ 614-623.

［4］ AYUSAWA M， SONOBE T， UEMURA S， et al. Revision of diagnostic guidelines for Kawasaki disease （the 5th revised edition）［J］. Pediatr Int， 2005， 47（2）︰ 232-234.

［5］ NEWBURGER J W， TAKAHASHI M， GERBER M A， et al. Diagnosis， treatment， and long-term management of Kawasaki disease︰ a statement for health professionals from the Committee on Rheumatic Fever， Endocarditis， and Kawasaki Disease， Council on Cardiovascular Disease in the Young，American Heart Association［J］. Pediatrics， 2004， 114（6）︰1708-1733.

［6］ FISH J E， SANTORO M M， MORTON S U， et al. miR-126 regulates angiogenic signaling and vascular integrity［J］. Dev Cell， 2008， 15（2）︰ 272-284.

［7］ MITCHELL P S， PARKIN R K， KROH E M， et al. Circulation microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2008， 105（30）︰10513-10518.

［8］ HUANG Z， HUANG D， NI S， et al. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer［J］. Int J Cancer， 2010， 127（1）︰ 118-126.

［9］ SHIMIZU C， KIM J， STEPANOWSKY P， et al. Differential expression of miR-145 in children with Kawasaki disease［J］. PloS One， 2013， 8（3）︰ e58159.

［10］ YUN K W， LEE J Y， YUN S W， et al， et al. Elevated serum level of microRNA （miRNA）-200c and miRNA-371-5p in children with Kawasaki disease ［J］. Pediatr Cardiol， 2014，35（5）︰ 745-752.

［11］ ROWLEY A H， PINK A J， REINDEL R， et al.A study of cardiovascular miRNA biomarkers for Kawasaki disease［J］. Pediatr Infect Dis J， 2014， 33（12）︰ 1296-1299.

［12］ NI F F， LI C R， LI Q， et al. Regulatory T cell microRNA expression changes in children with acute Kawasaki disease［J］. Clin Exp Immunol， 2014， 178（2）︰ 384-393.

［13］ ZHOU J， WANG K C， WU W， et al. MicroRNA-21 targets peroxisome proliferators-activated receptor-alpha in an autoregulatory loop to modulate flow-induced endothelial infl ammation ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108（25）︰10355-10360.

［14］ LI Y， YAN L， ZHANG W， et al. MicroRNA-21 inhibits platelet-derived growth factor-induced human aortic vascular smooth muscle cell proliferation and migration through targeting activator protein-1［J］. Am J Transl Res， 2014， 6（5）︰507-516.

［15］ ZUO K， LI M， ZHANG X， et al. MiR-21 suppresses endothelial progenitor cell proliferation by activating the TGF-beta signaling pathway via downregulation of WWP1［J］. Int J Clin Exp Pathol， 2015， 8（1）︰ 414-422.

［16］ RAITOHARJU E， LYYTIKAINEN L P， LEVULA M， et al. miR-21， miR-210， miR-34a， and miR-146ab are up-regulated in human atherosclerotic plaques in the Tampere Vascular Study［J］. Atherosclerosis， 2011， 219（1）︰ 211-217.

［17］ WANG M， LI W， CHANG G Q， et al. MicroRNA-21 regulates vascular smooth muscle cell function via targeting tropomyosin 1 in arteriosclerosis obliterans of lower extremities［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2011， 31（9）︰ 2044-2053.

［18］ SARKAR J， GOU D， TURAKA P， et al. MicroRNA-21 plays a role in hypoxia-mediated pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and migration［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2010， 299（6）︰ L861-L871.

［19］ JI R， CHENG Y， YUE J， et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation ［J］. Circ Res， 2007， 100（11）︰ 1579-1588.

［20］ ROY S， KHANNA S， HUSSAIN S R， et al. MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction︰ miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue［J］. Cardiovasc Res， 2009， 82（1）︰ 21-29.

［21］ CHENG Y， ZHU P， YANG J， et al. Ischaemic preconditioning-regulated miR-21 protects heart against ischaemiareperfusion injury via anti-apoptosis through its target PDCD4［J］. Cardiovasc Res， 2010， 87（3）︰ 431-439.

［22］ 褚茂平， 胡晨， 周爱华， 等. 川崎病血清特异相关miR-23a对人脐静脉内皮细胞生长及迁移的影响［J］. 温州医科大学学报， 2015， 45（5）︰ 321-326.

［23］ 褚茂平， 周爱华， 胡晨， 等. miR-130a和miR-125b在川崎病外周血细胞中的表达及意义［J］. 浙江医学， 2015， 37（5）︰357-362.

（本文编辑：丁敏娇）

Expression of miR-21 in patients with the acute phase of Kawasaki disease and its clinical signifi cance

JIA Lianhong1， PAN Lulu2， LU Jiacheng1， GENG Zhimin1， WU Rongzhou2， CHU Maoping2. 1.Department of Children’s Center， the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 2.Children’s Heart Center， the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital， Institute of Cardiovascular Development & Translational Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Abstract：Objective： To study the expression of miR-21 in the serum of patients with Kawasaki disease and its clinical signifi cance. Methods： Thirty-three cases of Kawasaki disease and 15 healthy control were collected from the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University in 2014 and 2015. With cel-miR-39 as the external reference gene， the expression of miR-21 was detected with realtime quantitative PCR， and its signifi cance as a marker in diagnosis was evaluated by ROC curve. Results： The expression of miR-21 in serum of KD patients was signifi cantly higher than that in the healthy control group （P＜0.05）， and return to normal level after treatment. ROC curve indicated miR-21 had a sensitivity of 84.6% and a specifi city of 71.4% for distinguishing KD patients from healthy children with an area under the curve （AUC）were 0.736 （95%CI︰ 0.531～0.941）. Further analysis of the clinical pathological features indicated that the level of serum miR-21was associated with PLT. Conclusion： Serum miR-21 level is signifi cantly elevated in KD patients， it may be used as a potential biomarker in diagnosis of KD.

Key words：Kawasaki disease； microRNA-21； disease diagnosis

［中图分类号］R725.4

［文献标志码］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.005

收稿日期：2016-01-22

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY12H02003）；浙江省医药卫生科技计划项目（2012ZDA035）；浙江省科技厅科研基金资助项目（2015C33163）。

作者简介：贾连红（1988-），女，河北三河人，硕士生。

通信作者：褚茂平，主任医师，Email：chmping@hotmail.com。