降脂酮对胰岛素抵抗大鼠肝损伤的保护作用

王　帅， 金　磊， 王　欣， 姬秋和， 张　伟， 海春旭， 李文丽

(第四军医大学毒理学教研室，西安　710032；*通讯作者，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)



降脂酮对胰岛素抵抗大鼠肝损伤的保护作用

王帅， 金磊， 王欣， 姬秋和， 张伟， 海春旭， 李文丽*

(第四军医大学毒理学教研室，西安710032；*通讯作者，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

摘要：目的观察降脂酮对胰岛素抵抗大鼠肝病理损伤的保护作用。方法将15只大鼠随机分成2组，即正常对照组5只、双高加tBHP(HF+tBHP)组10只。正常对照组，正常饲料喂养，5-6周隔天腹腔注射生理盐水。HF+tBHP组，高脂高果糖饲料喂养，5-6周隔天腹腔注射tBHP。第6周末，将HF+tBHP组随机分成两组:模型组5只，降脂酮组5只。模型组，双高饮食+tBHP，生理盐水灌胃；降脂酮组，双高饮食+tBHP，降脂酮200 mg/kg灌胃。6周末，测定空腹血糖、血清胰岛素含量、胰岛素敏感指数。12周末，处死大鼠，腹主动脉取血，分离血清，测定大鼠ALT和AST。取肝脏作HE染色石蜡切片和制作电镜切片。结果与对照组比较，模型组空腹血糖升高(P<0.05)，血清胰岛素含量降低(P<0.05)，胰岛素敏感指数降低(P<0.05)。降脂酮治疗后，光镜下观察肝细胞排列整齐，肿胀减轻；电镜下观察肝脏线粒体肿胀减轻，内质网扩张不明显。大鼠血清中ALT和AST的活性显著降低(P<0.05)。结论降脂酮能够保护高脂高果糖饮食加腹腔注射tBHP诱导的胰岛素抵抗大鼠的肝损伤。

关键词：降脂酮；胰岛素抵抗；叔丁基过氧化氢；肝损伤

2型糖尿病目前是全世界重大的公共卫生难题，日趋受到人们的重视。胰岛素抵抗是肥胖和2型糖尿病等各种代谢综合征的根本致病因子。研究表明，脂毒性和氧化应激与2型糖尿病的发生密切相关。胰岛素抵抗是2型糖尿病等各种代谢综合征的根本致病因素。中药作为我们国家的一个瑰宝日益受到广大民众的认可和欢迎。黄酮类化合物能清除机体内的自由基，被认为是一种较强的抗氧化剂[1]。近年来黄酮的保肝作用也引起了广泛的关注。降脂酮是从多种中药中提取的总黄酮，目前已有研究显示，降脂酮能改善CCl4诱导的急慢性肝损伤，起到显著的保肝作用[2]。本实验采用高脂高果糖加tBHP诱导的大鼠胰岛素抵抗模型为基础，研究中药提取物降脂酮对大鼠胰岛素抵抗肝损伤的作用，为筛选出高效低毒的治疗2型糖尿病的中药奠定实验基础。

1材料与方法

1.1实验动物及饲料配置

8周龄SPF级Sprague Dawley雄性大鼠，由第四军医大学实验动物中心提供。动物饲料由第四军医大学实验动物中心提供，大鼠自由摄食、饮水。动物实验环境温度为(24±2)℃，相对湿度为50%±10%，12 h/12 h交替照明和避光。第四军医大学饲料中心提供配置，配方为：普通混合饲料85%，猪油10%，果糖5%，60Co照射。

1.2主要试剂与仪器

罗氏卓越血糖仪，购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；日立7020生化仪，购自日立公司；大鼠胰岛素(INS)酶联免疫试剂盒，购自武汉华美生物工程有限公司；降脂酮为中国科学院化学所自由基研究室提供(黄酮含量>80%)；tBHP购自美国Sigma公司，果糖购自天津富宇精细化工有限公司。

1.3动物的处理与分组

将15只大鼠随机分成3组，即正常对照组(Control)5只、双高加tBHP(HF+tBHP)组5只。

正常对照组，正常饲料喂养，5-6周隔天腹腔注射生理盐水。HF+tBHP组，高脂高果糖饲料喂养，5-6周隔天腹腔注射tBHP 0.2 mmol/kg、0.5 ml/kg。第6周末，将HF+tBHP组随机分成两组：模型组5只，降脂酮组5只。正常组7-12周正常饲料喂养，每天生理盐水灌胃，隔天腹腔注射生理盐水；模型组7-12周双高饮食，每天生理盐水灌胃，隔天腹腔注射tBHP；降脂酮组7-12周双高饮食，每天降脂酮200 mg/kg灌胃，隔天腹腔注射tBHP。

1.4血清胰岛素含量测定和胰岛素敏感指数(ISI)计算

6周末，大鼠眼底静脉丛取血，分离血清。用大鼠胰岛素(INS)酶联免疫试剂盒测定SD大鼠空腹血清胰岛素的含量。利用公式ISI=ln[1/(血糖×血清胰岛素)]计算胰岛素敏感指数(ISI)。

1.5大鼠肝脏HE染色切片和大鼠肝脏电镜切片

12周末，大鼠腹腔注射苯巴比妥麻醉，开腹活体取小部分肝脏，置于4%甲醛中浸泡，制作石蜡切片，进行HE染色。光镜下观察各组大鼠肝脏病理变化。另取小部分肝脏置于2%戊二醛中浸泡，送电镜室做肝脏电镜切片，透射电镜下观察各组大鼠肝脏的超微病理变化。

1.6大鼠血清ALT和AST

12周末，大鼠开腹，腹主动脉取血，3 500 r/min离心10 min，取上清液即为大鼠血清。用生化仪测定大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性。

1.7统计学分析

数据以均数±标准差表示，应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析。α=0.05为检验水准。

2结果

2.1大鼠胰岛素抵抗模型的建立

HF+tBHP组与对照组比较，空腹血糖显著升高(P<0.05)，体内胰岛素敏感性降低(P<0.05)，代偿性的胰岛素分泌量增加(P<0.05，见表1)。

组别空腹血糖(mmol/L)空腹血清胰岛素(FINSmmol/L)胰岛素敏感指数(ISI)对照组5.02±0.3937.4±3.28-5.23±0.08 HF+tBHP组5.74±0.39*64.4±3.91**-5.90±0.04**

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2降脂酮对IR大鼠肝脏病理损伤的保护作用

在光镜下观察肝脏HE染色的病理学结构，对照组肝小叶规则，肝索以中央静脉为中心排列整齐，核仁无偏移，未见炎症细胞浸润。HF+tBHP组肝窦变窄,肝索排列紊乱，肝细胞肿胀，体积增大，有的细胞呈气球样变，可见炎症细胞浸润，提示肝脏存在炎症改变。降脂酮治疗后肝细胞结构基本正常，细胞核位于细胞中央，肝索排列较HF+tBHP组明显整齐，炎症细胞浸润明显减少(见图1)。

在透射电镜下放大倍数为20 500时可见，对照组肝细胞核周隙正常，线粒体形状规则，未见肿胀的线粒体和内质网；模型组线粒体肿胀变形，有的甚至呈球形，内质网扩张，排列紊乱；降脂酮治疗后，线粒体肿胀减轻，偶可见线粒体嵴，内质网扩张不明显(见图2)。

图1　肝脏光镜下病理学改变 (HE染色，×200)Figure 1　Change of pathology of livers under light microscope (HE staining，×200)

图2　肝脏超微病理结构改变(电镜，×20 500)Figure 2　Ultrastructural changes of livers under electron microscope (×20 500)

2.3降脂酮对胰岛素抵抗大鼠肝功能的影响

HF+tBHP组大鼠血清ALT、AST活性较对照组显著升高(P<0.05)。用降脂酮治疗后，大鼠ALT、AST活性显著降低(P<0.05，见图3)。

与对照组比较，*P<0.05;与HF+tBHP组相比，#P<0.05图3　降脂酮治疗后血清谷丙转酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性Figure 3　The changes of serum ALT and AST after treated with Jiangzhitong

3讨论

果糖作为食品添加剂，广泛用于食品、饮品中。果糖摄入的增加认为是一个潜在的肥胖流行因素。有研究表明，单纯饮用果糖水10周可使大鼠体重显著增加，并造成胰岛素抵抗[3]；高脂高糖、20%果糖水饲喂8周，并注射小剂量的链脲佐菌素(STZ)2周也可以诱导胰岛素抵抗大鼠模型[4]。由此可见，果糖与IR的产生密切相关。已知，ROS介导的炎症和氧化应激，与代谢综合征和T2DM的发病密切相关。ROS水平升高导致胰岛素信号的改变，但单纯ROS水平升高和氧化应激对诱导IR的研究至今甚少。近年有研究显示在高脂饮食喂养大鼠时加入氧化剂NOX2，对IR模型的建立起到了重要的作用。NOX2促进高脂饮食诱导的IR的发生，清除NOX2可提高肌肉组织胰岛素的敏感性，下调NOX2在骨骼细胞中的表达可提高胰岛素信号的敏感性[5]。因此，本实验综合以上研究结果，给予大鼠高脂高果糖饮食加腹腔注射氧化剂tBHP。结果表明，大鼠体重明显增加，空腹血糖显著升高，机体胰岛素敏感性降低，代偿性的胰岛素分泌量增加。以上结果均提示成功建立了胰岛素抵抗大鼠模型。

2型糖尿病患者50%并发肝损伤，而胰岛素抵抗是导致肝损伤的关键因素[6]。我们的研究结果表明，胰岛素抵抗大鼠的肝脏脂滴增多，线粒体肿胀，内质网扩张。究其原因可能是：在胰岛素抵抗状态下，脂肪代谢的调节作用减弱，血中游离脂肪酸含量升高，大量游离脂肪酸进入肝脏，超过肝细胞的承受能力，导致肝细胞中脂质的大量堆积。同时胰岛素抵抗下，产生大量的自由基，损伤线粒体，从而影响游离脂肪酸的代谢，加重肝细胞脂质蓄积[7]。另外，tBHP是一种氧化剂，本实验室前期的体外实验结果表明，它可以直接导致正常人肝细胞系发生线粒体肿胀，肝细胞凋亡[8]。本实验给予大鼠腹腔注射tBHP，它也可能直接参与了肝脏的损伤作用。因此，寻找改善IR大鼠肝损伤的药物显得尤为重要。

近年研究表明，黄酮类化合物能显著地预防和治疗胰岛素抵抗，并且具有显著的保肝作用。降脂酮是一种从黄芪、枸杞子、山楂等6种中药中提取的总黄酮，推测可能与黄酮具有类似的保肝作用[9]。国内研究[2,10]发现，降脂酮能降低CCl4诱导的急性肝损伤中NO和NOS的水平，还能显著降低AST和ALT活性，从而起到保护肝细胞的作用。但降脂酮对胰岛素抵抗大鼠的肝损伤作用还未见文献报道。本实验光镜观察显示，模型组大鼠肝细胞肿胀，肝索排列紊乱。降脂酮治疗后，大鼠肝细胞肿胀消失，肝索排列较整齐，肝脏脂滴显著减少；电镜观察结果显示，模型组大鼠肝细胞线粒体肿胀变形，内质网扩张。降脂酮治疗后大鼠肝细胞线粒体肿胀减轻，偶可见线粒体嵴，内质网扩张不明显。本实验通过对大鼠血清ALT、AST活性的测定显示：高脂高果糖加tBHP使大鼠血清中ALT、AST的活性显著升高，提示肝脏损伤的出现。可能与胰岛素抵抗导致的脂代谢紊乱和氧化应激相关。降脂酮治疗后，大鼠血清中ALT、AST的活性显著降低。推测可能是降脂酮参与肝脏中脂质的运输和氧化应激水平的降低。以上结果推测，多种中药提取物降脂酮可保护高脂高果糖和tBHP诱导的胰岛素抵抗大鼠的肝损伤。

参考文献：

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[3]刘微,李冀,盛波,等.胰岛素抵抗动物模型的研究进展[J].中医药信息,2008,25(6):9-11.

[4]Souto Padron De Figueiredo A,Salmon AB,Bruno F,etal.NOX2 mediates skeletal muscle insulin resistance induced by a high fat diet[J].J Biol Chem,2015,290(21):13427-13439.

[5]赵旭敏,李社莉.胰岛素抵抗与2型糖尿病肝损伤的研究进展[J].心血管康复医学杂志,2015,24(1):113-116.

[6]Avogaro A,De Kreutzenberg SV,Fadini GP.Oxidative stress and vascular disease in diabetes:is the dichotomization of insulin signaling still valid?[J] .Free Radic Biol Med,2008,44(6):1209-1215.

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[8]白贞子,姜艳芳,佟丽芳，等.降脂酮对CCl4诱导的大鼠慢性肝损伤的保护作用[J].吉林大学学报(医学版),2009,35(2):222-225.

[9]白贞子,牛俊奇,姜艳芳，等.降脂酮对CCl4所致急慢性肝损伤大鼠肝组织、血清中NO、NOS水平的影响[J].中国老年学杂志,2009,29(11):1333-1335.

[10]白贞子,盛传伦,苏秀芬，等.降脂酮对CCl4诱导的脂肪肝的保护作用[J].中国实验诊断学,2008,12(12):1501-1503.

Protective effect of Jiangzhitong on liver injury in rats with insulin resistance

WANG Shuai， JIN Lei， WANG Xin， JI Qiuhe， ZHANG Wei， HAI Chunxu， LI Wenli*

(ToxicologyTeachingandResearchSection，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；*Correspondingauthor，E-mail：liwenli@fmmu.edu.cn)

Abstract：ObjectiveTo explore the role of Jiangzhitong in the pathological damage of the liver in rats with insulin resistance.MethodsFifteen rats were randomly divided into two groups: control group(n=5) and high fat and high glucose plus tBHP group (HF+tBHP,n=10). Control rats were fed with normal diet and injected with saline every other day from the fifth to the sixth week. HF+tBHP rats were given high-fat, high-fructose diet, and they were injected intraperitoneally with tBHP from the fifth to the sixth week. At the end of the sixth week, the HF+tBHP rats were randomly divided into two groups: model group(n=5) and Jiangzhitong group(n=5). The rats in model group were given high-fat, high-fructose diet and injected with tBHP from the seventh to the twelfth week, and the rats in Jiangzhitong group were given high-fat, high-fructose diet, Jiangzhitong 200 mg/kg orally and injected with tBHP. At the end of the sixth week, fasting blood glucose, serum fasting insulin levels, insulin sensitivity index were measured. At the end of the twelfth week, the rats were sacrificed and the livers were prepared for HE staining, oil red staining and electron microscopy slice. ResultsCompared with control group, the fasting blood glucose increased(P<0.05), the serum insulin level decreased(P<0.05), and the insulin sensitivity index decreased in model group(P<0.05). After treated with Jiangzhitong, liver cells were arranged neatly, and the swelling of liver cells was relieved. The results of electron microscope showed that the swelling of the mitochondrial was relieved in liver cells in Jiangzhitong group, and the endoplasmic reticulum wasn’t obvious. The ALT and AST in serum of rats were decreased in Jiangzhitong group(P<0.05). ConclusionJiangzhitong can alleviate the liver injury in insulin resistance rats induced by high fructose, high fat and tBHP.

Key words:Jiangzhitong;insulin resistance;tBHP;liver injury

基金项目：国家科学自然基金资助项目(31170807)；陕西省自然科学基金青年人才基金资助项目(2013JQ4018)

作者简介：王帅，女,1989-08生，在读硕士，E-mail：992751204@qq.com

收稿日期：2016-02-29

中图分类号：R587

文献标志码：B

文章编号：1007-6611(2016)05-0411-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.003