蛋白激酶C在血管收缩中的调节机制

高　燕, 冯秀娥

(山西医科大学药学院，太原　030001；*通讯作者，E-mail:xiuefeng@163.com)



蛋白激酶C在血管收缩中的调节机制

高燕, 冯秀娥*

(山西医科大学药学院，太原030001；*通讯作者，E-mail:xiuefeng@163.com)

关键词：蛋白激酶C；血管收缩；肌球蛋白轻链磷酸酯酶；Ca2+通道

血管的收缩可以调节血管紧张度，引起血流量和血压的变化。在高血压、糖尿病等慢性疾病的发病过程中，蛋白激酶C(PKC)信号通路表达异常会引起血管收缩功能异常，进而影响发病进程[1,2]。在血管平滑肌上以及与其相关的神经末梢表达有多种PKC的亚型，并且大量研究表明PKC的活性与血管收缩密切相关。血管的收缩主要通过收缩蛋白、信号分子、离子通道等进行调节，通过了解PKC对这些因素的影响，揭示其对血管收缩的调节机制，对于治疗相关疾病具有重要意义。本文就PKC在血管收缩过程中调节作用的机制进行综述。

1PKC概述

1.1PKC的分类

Nishizuka等[3]于1977年首次在鼠脑的胞质成分中发现了一种磷脂和钙依赖性的蛋白激酶，将其确认为PKC。此后，众多学者对PKC的结构特点、遗传特性、激活方式、生理功能及分布特征等进行了深入研究。迄今，经分离纯化的PKC亚型共有12种。依据与PKC调控区域连接的第二信使不同可将PKC家族分为三大类型，分别为经典型PKC(cPKC，包括α、βⅠ、βⅡ、γ亚型)、新型PKC(nPKC，包括δ、ε、η、θ亚型)、非典型PKC(aPKC，包括ζ、ι/λ亚型)[4]。cPKC是二酰基甘油(DAG)和Ca2+依赖性的；nPKC的激活不依赖Ca2+，由DAG激活；aPKC是非DAG和Ca2+依赖性的，受磷脂的调节。PKC的分布广泛，其各亚型具有种属及组织特异性。血管平滑肌上主要表达有PKC α、β、δ、ε、θ、ι/λ、ζ。研究表明，PKCα、δ、ε在平滑肌的收缩过程中具有重要作用[5]。

1.2PKC的结构

PKC是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是由737-872个氨基酸组成的单链多肽，分子量约为67-83 kD。对PKC同工酶的cDNA分析可知，其N-端为疏水的调节域，提供Ca2+、DAG、佛波酯的连接位点，C-端为亲水的催化域，两端被“铰链区”(V3)连接，该区可被蛋白酶水解(见图1)。每个区域共分为4个保守区和5个可变区，调节域包括Vl、C1、V2、C2/V0四个区[6]，催化域包括C3、V4、C4、V5四个区。C1区是膜结合区，是DAG或佛波酯结合位点，由富含半胱氨酸和组氨酸的C1A和C1B序列串联组成，协调锌离子，稳定锌指样结构[7]；C2区与酶对Ca2+的敏感性有关，nPKC、aPKC无C2区，其V0区类似于C2区的功能，但因缺乏天冬氨酸残基，呈非Ca2+依赖型；C3区含酶催化位点和ATP结合位点；C4区可能与识别磷酸化的底物有关；V1区决定各同工酶对底物的选择性；V3区为铰链区，含酪氨酸酶作用位点；V5区调节PKC的磷酸化。cPKC含有全部4个保守区，nPKC无C2区，aPKC只有部分半胱氨酸区且无C2区。

图1　PKC的结构特点

1.3PKC的激活

PKC通常以无活性的形式存在于细胞质中，当被激活时从胞质转移到细胞膜上。信号分子作用于细胞膜上的受体，激活G蛋白，而后G蛋白激活磷脂酶C(PLC)，PLC使磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)水解为第二信使三磷酸肌醇(IP3)和DAG，IP3动员细胞内钙库释放Ca2+到细胞质中与钙调蛋白结合，而DAG在Ca2+的协同下激活PKC。PKC在催化功能区连接有一个具有自抑作用的假底物来抑制其活性，一旦PKC被DAG、Ca2+和磷脂酰丝氨酸结合，PKC的构象改变会使假底物从催化结构域释放，与其受体结合激活细胞质中的酶，从而参与调控各种生化反应，其作用于细胞核中的受体还可以参与基因调控。当底物的结合位点暴露后，位于细胞膜上的1型磷酸肌醇依赖性激酶(PDK1)使PKC的苏氨酸位点磷酸化，阻止假底物序列重新与PKC结合，从而稳定PKC的激活构象[8]。

2血管收缩的机制

2.1钙动员机制

Ca2+由胞外流入或从细胞内释放使[Ca2+]i升高，可引起血管平滑肌的收缩。外钙流入可以通过激动剂作用于膜上的受体，也可以通过离子通道。激动剂作用于膜受体，激活G蛋白后引起一系列反应生成IP3，IP3作用于其受体使Ca2+从肌浆网释放，引起[Ca2+]i升高。此外，Ca2+还通过VDC、ROC、其他离子载体所引起的外钙内流(Na+/Ca2+交换体、漏通道等)以及钙释放激活的钙通道等机制由胞外流入胞内，从而使[Ca2+]i升高。平滑肌细胞兴奋时，胞内游离Ca2+水平升高达到激活浓度，与胞质内的钙调蛋白相结合，进而再与肌球蛋白轻链激酶(MLCK)结合为三元体而激活，促使肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化，激活肌球蛋白上的ATP酶，肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，横桥牵引细肌丝，引起平滑肌细胞收缩。

2.2钙敏感机制

血管平滑肌细胞还可以通过钙敏感机制维持其收缩作用。肌球蛋白轻链磷酸酯酶(MLCP)可将磷酸化的MLC上的高能磷酸键移除，使MLC脱磷酸化，从而引起血管平滑肌松弛。钙敏感机制即通过抑制MLCP，增加磷酸化MLC的水平，增强收缩过程中收缩或调节结构对Ca2+的敏感性，增强平滑肌的收缩作用[9]。

3PKC对血管收缩的调节

3.1PKC增加磷酸化的MLC水平

血管的激动剂可以调节MLC20的磷酸化水平，从而影响血管收缩。MLCK和MLCP可以对MLC20进行双向调节。激活MLCK可以促进MLC20磷酸化，引起肌球/肌动蛋白的相互作用，导致血管平滑肌收缩。而激活MLCP可以将MLC20去磷酸化，抑制MLCP可使MLC维持其磷酸化状态。MLCP是由37 kD的1型蛋白磷酸酶催化亚基(protein phosphatase 1 catalytic subunit，PP1c)，130 kD的肌球蛋白靶亚基(myosin phos-phatase target subunit，MYPT)和20 kD的未知亚基组成[10]，在平滑肌细胞中高度表达。PKC可通过多种途径抑制MLCP，增强MLC20的磷酸化，参与平滑肌收缩的钙敏感机制[11]。PKC可以使MLCP的调节亚基MYPT1磷酸化，抑制MLCP。另外，PKC可以使17 kD的PKC依赖性蛋白质磷酸酶1抑制剂(CPI-17)磷酸化，将其转换成一种MLCP的有效抑制剂，减少MLC20的去磷酸化，促进平滑肌收缩[12-14]。

3.2PKC对Ca2+通道的影响

L型Ca2+通道(L-VDCC)又称CaV1.2，胞外Ca2+通过CaV1.2流入，[Ca2+]i水平升高，可以引起平滑肌收缩。Ca2+与PKC信号通路具有相互作用，Ca2+作为辅因子可以直接激活PKC，而PKC在体内和体外水平调节CaV1.2，使其磷酸化。PKC介导的CaV1.2磷酸化作用不仅可以调节外钙内流，还可以调节胞内Ca2+经Ca2+-ATP酶释放[15]。另外，PKC还可以通过增强胞内Ca2+的敏感性，使肌细胞膜去极化，促进Ca2+通过VDCC流入胞内。PKC已被作为引起脑动脉平滑肌VDCC开放的重要因素。在生理条件下，PKC的活性增强是由于激活剂作用于G蛋白偶联受体(GPCR)。血管收缩剂，如血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内皮素-1(ET-1)和乙酰胆碱(Ach)主要通过作用于平滑肌上的Gq蛋白偶联受体，诱发胞内贮钙释放，同时促进Ca2+通过L-VDCC流入胞内[16]。激活PKC在Gq蛋白偶联受体等调节CaV1.2的过程中具有重要作用。PKC的抑制剂可以阻断AngⅡ引起的收缩[17]。佛波醇酯和DAG可以增加CaV1.2开放的频率和时间，抑制其关闭，增强平滑肌收缩作用。通过G蛋白激活磷脂酶PLC-IP3通路的另一个重要作用对象是瞬时受体电位通道(TRPC)[18]，TRPC不仅可以直接介导Ca2+内流，还可以通过引起细胞膜去极化从而激活CaV1.2，增加Ca2+流入。PKC激活的神经递质和激素调节平滑肌CaV1.2通道可能是通过直接对通道的磷酸化，也可以影响PKC和某些通道亚基的相互作用，或通过以上两种途径共同作用。然而，在爪蟾卵母细胞和人long-NTα1C亚型实验中发现，PKC除了可以增强CaV1.2外，也可以对其具有双向调控作用，即先对其表现增强作用后对其进行抑制[19-21]。另外，也有报道显示，PKC还可以对CaV1.2仅表现其抑制作用[22]。PKC对CaV1.2不同调控作用的具体机制尚不明确，可能与PKC或CaV1.2各亚型的物种、年龄、组织和疾病的差异性有关。

3.3PKC对K+通道的影响

K+通道可以通过控制膜电位和胞内Ca2+信号，实现对血管收缩的调节。开放K+通道可以使膜电位超极化，从而抑制Ca2+内流，而关闭K+通道可以增加胞质内的Ca2+浓度。血管平滑肌细胞上表达有五种不同的K+通道，分别是：Ca2+激活型钾(KCa)通道、电压依赖型钾(KV)通道、ATP敏感型钾(KATP)通道、内向整流型钾(Kir)通道和双孔道钾(K2P)通道。其中，Kv通道是调节血管紧张度和静息膜电位的主要决定因素[23]。研究认为激活PLC和PKC可以介导由于抑制KV通道引起的血管平滑肌收缩。使用PLC的抑制剂U73122和经典型PKC的抑制剂Gö6976可阻断5-羟色胺对KV通道的抑制作用[24]。诱导PKC易位系统的表达显示，在A7r5鼠主动脉和肠系膜动脉平滑肌细胞PKC的激活足以抑制内源性的KV7电流。精氨酸加压素(100和500 pmol/L)和PKC激活剂佛波醇(12-myristate-13-acetate，1 nmol/L)均可抑制人类KV7.5和KV7.4/7.5。人的KV7.5和KV7.4/7.5通道的抑制与PKC依赖性的通道亚单位的磷酸化增强有关[25]。

K2P通道可以被分为TWIK1，2(串联的两个P结构域形成弱内向整流钾通道)、TREK(TWIK相关的钾通道)、TASK1-5(与TWIK相关的对酸敏感钾通道)、TRAAK(TWIK-相关的花生四烯酸激活钾通道)、TALK、THIK、和TRESK等亚型[26]。K2P受磷酸化和多种GPCR的调控。GPCR的调控作用可能与PKC下游的信号分子激活K2P通道有关。PKC通过激活毒蕈碱受体M1，M3来抑制重组TASK3[27]。PDBu激活PKC可以部分抑制TREK-1[28]。

在大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)通过PKA和PKCε抑制KATP通道和KV通道[29]。AngⅡ引发的兔冠状动脉Kir通道的抑制作用是由PKCα介导[30]。埃他卡林是一种新型KATP通道开放剂。体外实验中，埃他卡林可以明显减少组织缺氧引起的PKC的超表达，并且这种效应可以被选择性KATP通道阻断剂格列苯脲所抑制。

3.4PKC对PIP2的调节

PIP2是磷脂类信号分子，分布在细胞膜，在细胞中的分布和含量受多种因素调节。血管收缩剂通过细胞表面的Gq/11偶联受体激活PLC，分解PIP2产生第二信使IP3和DAG。IP3引起肌浆网上的Ca2+释放，从而使平滑肌收缩。DAG可介导PKC的移位和激活，增加MLC磷酸化和肌丝对Ca2+的敏感性，从而加强收缩作用。DAG可以直接介导PKC的激活，而IP3可通过促进内钙释放从而调节钙依赖型PKC。PIP2可水解为IP3和DAG，亦可直接作为第二信使参与血管的收缩过程。研究表明PIP2对离子通道和离子转运体具有调节作用，先后发现其与KATP、Na+-Ca2+交换体(NCX)、VGCC、M型钾通道(KCNQ，KV7)、TRPC和内向整流型钾通道(Kir)等离子通道和转运体的功能有关。PKC可以催化离子通道蛋白磷酸化，改变通道蛋白与PIP2的亲和力，从而影响PIP2对离子通道的调节作用。PI4K和PIP5K是PIP2合成过程中的关键酶，其中PI4K使IP肌醇环4位磷酸化生成PIP，PIP5K进一步催化PIP肌醇5位使其磷酸化成为PIP2[31]。PKC参与激活PI4K或PIP5K，从而调节细胞膜中PIP2的水平。牛的精子获能实验表明PKC可以激活PI4K[32]。而在爪蟾卵母细胞中，PKC也可以通过激活PI4K，进而使PIP2的水平升高[33]。研究表明，cAMP通路与PKC通路间的相互作用可能对PIP5Kβ的活性具有调节作用[34]。

3.5PKC对NO的抑制作用

血管内皮主要通过合成和释放各种舒张因子和收缩因子实现血管紧张度的调节。NO是由左旋精氨酸经一氧化氮合酶(NOS)生成的一种强效的舒血管物质，eNOS是内皮源性NO的主要合成酶。NO的释放与多种调控eNOS的机制相关，包括小窝蛋白、AMPK、Ca2+-CaM复合体或受体(雌激素、胰岛素、毒蕈碱)介导的机制。细胞胞质内Ca2+浓度升高，Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合物，eNOS与该复合物结合后构象发生变化，使电子流从还原亚基转换成氧化亚基，催化NO的生成。激活PKC能够使eNOS的酶活性降低，从而减少NO的生成。另外，激活PKC会增加NAD(P)H氧化酶依赖性超氧阴离子的水平。超氧阴离子可将NO转化为过氧硝酸盐类，从而减少NO的生物利用度和生理活性，导致血管收缩。eNOS T495的磷酸化作用具有PKC依赖性，而磷酸化的T495D eNOS(人类亚型)的表达可以增加超氧阴离子的水平，且减少NO的产生[35]。研究发现PKCα、PKCδ、PKCε、PKCθ影响丙泊酚的舒张血管作用，内皮完整时通过PKC-eNOS-NO信号通路调节丙泊酚引起的血管舒张[36]。

4结语

血管收缩异常是高血压发病的主要因素，PKC在调节血管收缩过程中具有重要作用(见图2)。PKC各亚型的分布及其生物活性具有组织和疾病差异性，发现和运用这些亚型特异性的强效抑制剂或激动剂有利于进一步深入探索PKC的作用机制。通过深入研究PKC的作用机制，可以为临床治疗这些心血管疾病，明确胞内靶部位提供新的思路和方法。此外，PKC在心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心律失常、动脉粥样硬化等其他多种心血管疾病的发生发展过程中均呈现出表达水平和生物活性的改变。近年来，研究发现了多种在PKC的成熟、亚细胞定位及下调过程中具有重要意义的关键因子。PKC表达水平的变化可以直接影响PKC信号通路，理解调节PKC水平的机制对于相关疾病的治疗具有重要意义。总之，PKC通路与其他信号通路之间存在复杂的相互作用，对于PKC的研究仍有许多方面需要了解，这些问题均可成为重要的研究方向。

图2　蛋白激酶C对血管收缩过程的影响

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基金项目：国家自然科学基金资助项目(81473100)；山西省自然科学基金资助项目(2013011060-2)；山西医科大学博士启动基金资助项目(B03201213)

作者简介：高燕,女,1991-06生,在读硕士,E-mail：410526486@qq.com

收稿日期：2016-02-24

中图分类号：R337

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)05-0481-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.020