牙龈卟啉单胞菌合成环二腺苷酸的高效液相色谱-串联质谱法定性分析

谭咏梅　杨小军　杜娟　赵望泓　陈晓丹　侯晋.南方医科大学南方医院口腔科；.南方医科大学公共卫生与热带医学学院卫生监测中心，广州 5055；.汕头大学医学院第二附属医院口腔科，汕头 5504



牙龈卟啉单胞菌合成环二腺苷酸的高效液相色谱-串联质谱法定性分析

谭咏梅1杨小军1杜娟2赵望泓1陈晓丹3侯晋1
1.南方医科大学南方医院口腔科；2.南方医科大学公共卫生与热带医学学院卫生监测中心，广州 510515；3.汕头大学医学院第二附属医院口腔科，汕头 515041

[摘要]目的定性检测牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）是否能产生细菌信号分子环二腺苷酸（c-di-AMP），为探索其在P.gingivalis生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。方法以P.gingivalis标准菌株ATCC33277为实验菌株，抽提细菌内核酸物质作为样品，配置c-di-AMP标准品，通过高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）和高效液相色谱法（HPLC）对样品进行验证。结果HPLC-MS/MS检出限按照信噪比（S/N）3∶1计算，c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49 min，P.gingivalis提取物样品在保留时间为8.82 min时有目标峰出现（大于3 S/N）。HPLC检测结果表明，P.gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7 min处出现目标峰，且二者的紫外吸收光谱相同。结论牙龈卟啉单胞菌核酸提取物中含有c-di-AMP，牙龈卟啉单胞菌可以合成产生c-di-AMP。

[关键词]环二腺苷酸；牙龈卟啉单胞菌；高效液相色谱-串联质谱法

Supported by: National Natural Science Foundation of China (81500870);President Foundation of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2013Z006, 2012C005).Correspondence: Hou Jin, E-mail: houjin@smu.edu.cn.

环二鸟苷酸[bis-（3’-5’）-cyclic dimeric guano-sine monophosphate，c-di-GMP]和环二腺苷酸[bis-（3’-5’）-cyclic dimeric adenosine monophosphate，c-di-AMP]是近年来新发现的，在细菌和古细菌中广泛存在的信号分子[1-2]。目前的研究结果显示，c-di-GMP作为第二信使，在细菌的蠕动、毒力因子的表达、生物膜的形成、细胞周期、细胞间通讯以及细菌对宿主细胞的入侵等过程中发挥着重要的调节作用，是细菌生存和代谢的关键性调节因子之一[3-5]。与c-di-GMP相比，c-di-AMP的发现较晚，研究相对较少，因此对其功能了解十分有限。现有研究结果显示，c-di-AMP与细菌肽聚糖稳态、细胞耐药性、细菌大小、生物膜形成、肺炎链球菌菌链的长度以及细菌感染有着密切的关系，并且其在不同的菌种中发挥着不同的调节功能[6]。

c-di-AMP是通过二腺苷酸环化酶（diadenylate cyclase，DAC）由两分子的ATP或ADP合成而来，而其降解代谢与c-di-GMP一样都是通过磷酸二酯酶来完成。2008年Witte等[7]在研究细菌的Checkpoint 蛋白DisA的过程中发现，该蛋白结构中有一个未知功能的结构域147（domain of unknown function 147，DUF147），其具有二腺苷酸环化酶的活性，能将两分子的ATP合成一分子的环二磷酸腺苷，因此该结构域又被命名为DAC结构域。由于该结构域多耦联于DisA蛋白中，并且位于DisA蛋白的氨基端，所以又被称为DisA_N结构域。Pfam数据库中的数据显示，11 352个物种中都含有DisA_N结构域。说明c-di-AMP这个信号分子在细菌中广泛存在。通过常规的生物学方法敲除c-di-AMP的合成蛋白基因会导致多种细菌死亡，提示c-di-AMP在细菌的生命代谢过程中发挥着重要作用，是细菌生长所必需的信号分子。除此之外，c-di-AMP还可以作为病原相关的分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被宿主细胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）特异性识别，激活宿主的固有免疫应答反应[2]。

虽然研究者已经在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[8]、李斯特菌（Listeria monocytogenes）[9]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[10]以及乳酸球菌（Lactococcus lactis）[11]等细菌的核酸提取物中检测到了c-di-AMP的存在，但有关牙周炎致病菌牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）中c-di-AMP的研究迄今为止未见报道。本研究的目的是通过高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，HPLC-MS/MS）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）定性检测P.gingivalis是否能产生细菌信号分子c-di-AMP，为探索c-di-AMP在P.gingivalis生命代谢以及牙周炎免疫中的作用奠定基础。

1　材料和方法

1.1实验细菌

P.gingivalis ATCC 33277菌株购自美国Microbiologics公司。

1.2主要试剂及仪器

胰酶大豆肉汤（Tryptic Soy Broth，TSB）培养基、L-盐酸半胱氨酸、氯化血红素、维生素K3（Sigma公司，美国），无菌脱纤维绵羊血（广州蕊特生物科技有限公司），c-di-AMP标准品（Invivogen公司，美国），色谱纯甲醇、乙腈（Merck公司，德国）。

Anoxomat Mark Ⅱ厌氧微需氧培养系统（MART公司，荷兰），电子天平（Sartorius公司，德国），正置相差显微镜及照相系统（Olympus公司，日本），生物安全柜（上海振阳设备有限公司），离心机（Thermo公司，美国），AB4000液相色谱串联质谱联用仪（MDS Sciex公司，美国），氮吹仪（Organomation公司，美国），API 4000 QTrap HPLC-MS/ MS联用仪配有Agilent1200高效液相色谱（Agilent Technologies公司，美国），Shim-pack XR-ODS色谱柱（岛津公司，日本），Phenomenex C-18色谱柱（Phenomenex公司，美国）。

1.3细菌培养

将P.gingivalis ATCC33277复苏后接种于TSB血琼脂培养基（含50 mL·L-1冻溶羊血、0.5 g·L-1L-盐酸半胱氨酸、5 mg·L-1氯化血红素和1 mg·L-1维生素K3），37 ℃厌氧培养（80%N2、10%CO2、10%H2）。

1.4样品的提取与纯化

样品提取的方法参考文献[12-13]。取5 mL对数生长期（OD690≈0.8）的细菌菌液，4 ℃、2 500 g离心20 min，弃上清，加入1 mL的培养基重悬细菌沉淀物，4 ℃、2 500 g离心20 min，弃上清，往沉淀中加入300 μL的提取液（乙腈∶甲醇∶水=2∶2∶1），冰上孵育15 min，放入95 ℃加热10 min后立即在冰上冷却，4 ℃、20 800 g离心10 min，将上清转移到另一支2 mL的离心管中。再往细菌沉淀物中加入200 μL的提取液，冰上孵育15 min，4 ℃，20 800 g离心10 min，收集上清（该步骤重复2次）。将所获得的上清-20 ℃冷冻过夜。次日，4 ℃、20 800 g离心10 min，收集上清。将获得的核酸提取物样品在氮气流中吹干，用甲醇复溶，上机检测。

1.5c-di-AMP标准品溶液的配制

在c-di-AMP标准品中加入1 mL色谱级甲醇，溶解，混匀，配置成1 mg·mL-1的储存液。将标准品储存液用色谱级水稀释，配成10 ng·mL-1和100 ng·mL-1的标准品溶液。

1.6HPLC-MS/MS检测

采用HPLC-MS/MS检测样本和标准品。1）环境条件：温度15～30 ℃，相对湿度小于等于80%。2）色谱条件。色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODS （75 mm×2.0 mm）；流动相：甲醇作为有机相，10 mmol·L-1的醋酸铵加0.1%醋酸作为水相；流速：0.3 mL·min-1；柱温：室温；进样量：5 μL。质谱条件见表1；离子源为ESI源，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）扫描模式，喷雾电压为5 500 V，离子源温度350 ℃，气帘气15.0 kPa，离子源气体12.0 kPa。

表1　c-di-AMP的质谱检测条件Tab 1　Mass spectrometry conditions of c-di-AMP

1.7HPLC检测

采用HPLC对样品和标准品进一步验证。1）环境条件。温度：15～30 ℃，相对湿度小于等于80%。2）色谱条件。色谱柱：Phenomenex C-18（150 mm× 4.60 mm）；体系：采用A和B双泵系统，流动相A相为10%乙腈+0.1%甲酸，B相为90%乙腈；流量：1.000 mL·min-1；低压限值：0.00 bar；高压限值：400.00 bar；梯度洗脱程序：0～20 min，A：20.0%，B：80.0%；21～24 min，A：0.0%B：100.0%；25～ 30 min，A：95.0%，B：5.0%。柱温：室温；进样量：30.00 µL。HPLC结果以保留时间和紫外吸收光谱定性，即通过将c-di-AMP标准品的保留时间与P.gingivalis核酸提取样品进行比对，再结合相应的光谱曲线，对样品进行定性分析。

2　结果

2.1生物信息学检索

通过生物信息检索发现，在已知基因序列的P.gingivalis菌株中具有腺苷酸环化酶活性的DisA_N结构域（表2）。已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA均包含255个氨基酸。在美国国家生物技术信息中心数据库（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中对已知基因序列的P.gingivalis菌株的DisA氨基酸序列进行比对发现，ATCC33277、TDC60和F0569的DisA蛋白具有完全相同的氨基酸序列，而其余8个菌株的DisA的氨基酸序列完全相同（表2）。氨基酸序列之间的相似性为99%，两者之间只是羧基末端的第252位氨基酸不同，但DisA_N结构域的区域为8～249位氨基酸，因此该差异氨基酸并不位于DisA_N结构域内。

表2　牙龈卟啉单胞菌不同菌株中DisA蛋白的基因位点及其所编码的蛋白Tab 2　Locus and protein of DisA of P.gingivalis strains

2.2HPLC-MS/MS检测

HPLC-MS/MS检测结果见图1。HPLC-MS/MS检出限按照信噪比（S/N）3∶1计算，c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49 min，P.gingivalis提取物样品在保留时间为8.82 min时有目标峰出现（大于3 S/N），而且提取物中含有与标准品分子量一致的物质。这表明，P.gingivalis的菌体核酸提取物中含有c-di-AMP。

图1　牙龈卟啉单胞菌提取物的HPLC-MS/MS检测结果Fig 1　HPLC-MS/MS results of samples from P.gingivalis

2.3 HPLC检测

HPLC检测结果见图2。P.gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7 min处出现目标峰，且二者的紫外吸收光谱相同。这表明，样品中含有与标准品为同一物质的c-di-AMP。

图2　c-di-AMP标准品和牙龈卟啉单胞菌提取物样品的高效液相色谱检测结果Fig 2 HPLC results of c-di-AMP standard and nucleotide samples from P.gingivalis

3　讨论

c-di-AMP是细菌中广泛存在的环二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）信号分子，由两分子的ATP或ADP在二腺苷酸环化酶的作用下合成而来。Pfam数据库中的数据显示，11 352个物种中的12 702种蛋白都含有具有二腺苷酸环化酶活性的DAC结构域即DisA_N结构域。该结构域常常与其他功能的结构域偶联在一起，而且不同功能结构域的组合方式已经发现的有21种之多，如DNA结合功能域、跨膜信号肽、PAS功能域、蛋白激酶功能域、磷酸化功能域以及功能未知的蛋白功能域等，说明c-di-AMP在细菌的生命代谢过程中扮演着多重角色。本研究通过生物信息检索发现在已知基因序列的牙龈卟啉单胞菌的菌株中皆存在DisA_N结构域，该结果表明牙周致病菌P.gingivalis可能会合成和分泌c-di-AMP。本

研究以P.gingivalis标准株ATCC33277为实验菌株，通过HPLC-MS/MS定性检测P.gingivalis菌体提取物中是否存在c-di-AMP。实验结果显示，检出限按照信噪比（S/N）3︰1计算，浓度为10 ng·mL-1 的c-di-AMP标准品出峰的保留时间为7.49 min，P.gingivalis提取物样品在保留时间为8.82 min时有目标峰出现（大于3 S/N）。因此，考虑P.gingivalis核酸提取物中可能含有c-di-AMP。由于样品与标准品出峰时间的差异，笔者采用HPLC法对样品和标准品进行进一步的验证。本研究采用乙腈和甲酸对样品进行等梯度洗脱，HPLC结果以保留时间和紫外吸收光谱定性，即通过将P.gingivalis核酸提取样品的保留时间与c-di-AMP标准品进行比对，再结合相应的光谱曲线，对该样品进行定性分析。结果显示：P.gingivalis核酸提取物样品及c-di-AMP标准品均在15.7 min处出现目标峰，而且样品与标准品峰的紫外吸收光谱相同，因此，可以认为P.gingivalis核酸提取物中含有c-di-AMP，即P.gingivalis可以合成和分泌c-di-AMP。

色质联用法在检测分析过程中还存在色谱条件优化的问题，在本研究中，c-di-AMP标准品及牙龈卟啉单胞菌核酸提取物样品两者出峰时间不同，可能是受到了基质干扰、流动相、色谱柱以及实验环境等多方面的影响，检测条件还需进一步优化。

c-di-AMP作为细菌重要的信号分子，研究显示：过量的c-di-AMP可干扰枯草芽孢杆菌肽聚糖的合成[8]；在金黄色葡萄球菌和乳酸球菌中，菌胞内cdi-AMP水平的升高可帮助细菌适应极端环境[10-11]，而且菌胞内c-di-AMP水平的升高有助于金黄色葡萄球菌的生长和分裂，这表明其在细菌的生命代谢过程中发挥着重要作用。c-di-AMP除了在细菌的生命代谢过程中扮演第二信使的角色外，还可被细胞内的某些DNA受体类的PRRs识别，调节干扰素（interferon）-β介导的免疫反应的活性，引发宿主的固有免疫反应[14-17]。入侵到宿主细胞内的细菌所产生的c-di-AMP可以被宿主细胞胞浆内的一类PRRs所感知，并激活宿主细胞的Ⅰ型干扰素反应[9]。本研究证明了牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌可合成c-di-AMP，但是c-di-AMP在其生命代谢中的作用，以及入侵到宿主细胞内的P.gingivalis所产生的c-di-AMP是否能激活宿主的Ⅰ型干扰素反应，并在牙周炎的免疫应答反应中发挥作用，还有待于进一步的深入研究。

[参考文献]

[1]Ryjenkov DA, Tarutina M, Moskvin OV, et al.Cyclic diguanylate is a ubiquitous signaling molecule in bacteria: insights into biochemistry of the GGDEF protein domain[J].J Bacteriol, 2005, 187(5):1792-1798.

[2]Römling U.Great times for small molecules: c-di-AMP, a second messenger candidate in Bacteria and Archaea[J].Sci Signal, 2008, 1(33):e39.

[3]Schirmer T, Jenal U.Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling[J].Nat Rev Microbiol, 2009, 7(10): 724-735.

[4]Mills E, Pultz IS, Kulasekara HD, et al.The bacterial second messenger c-di-GMP: mechanisms of signalling[J].Cell Microbiol, 2011, 13(8):1122-1129.

[5]Povolotsky TL, Hengge R.‘Life-style’ control networks in Escherichia coli: signaling by the second messenger c-di-GMP[J].J Biotechnol, 2012, 160(1/2):10-16.

[6]Corrigan RM, Gründling A.Cyclic di-AMP: another second messenger enters the fray[J].Nat Rev Microbiol, 2013, 11 (8):513-524.

[7]Witte G, Hartung S, Büttner K, et al.Structural biochemistry of a bacterial checkpoint protein reveals diadenylate cyclase activity regulated by DNA recombination intermediates[J].Mol Cell, 2008, 30(2):167-178.

[8]Mehne FM, Gunka K, Eilers H, et al.Cyclic di-AMP homeostasis in bacillus subtilis: both lack and high level accumulation of the nucleotide are detrimental for cell growth[J].J Biol Chem, 2013, 288(3):2004-2017.

[9]Woodward JJ, Iavarone AT, Portnoy DA.c-di-AMP secreted by intracellular Listeria monocytogenes activates a host type Ⅰinterferon response[J].Science, 2010, 328(5986):1703-1705.

[10]Corrigan RM, Abbott JC, Burhenne H, et al.c-di-AMP is a new second messenger in Staphylococcus aureus with a role in controlling cell size and envelope stress[J].PLoS Pathog, 2011, 7(9):e1002217.

[11]Smith WM, Pham TH, Lei L, et al.Heat resistance and salt hypersensitivity in Lactococcus lactis due to spontaneous mutation of llmg_1816 (gdpP) induced by high-temperature growth[J].Appl Environ Microbiol, 2012, 78(21):7753-7759.

[12]Burhenne H, Kaever V.Quantification of cyclic dinucleotides by reversed-phase LC-MS/MS[J].Methods Mol Biol, 2013, 1016:27-37.

[13]Spangler C, Böhm A, Jenal U, et al.A liquid chromatography-coupled tandem mass spectrometry method for quantitation of cyclic di-guanosine monophosphate[J].J Microbiol Methods, 2010, 81(3):226-231.

[14]Ishikawa H, Barber GN.STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling[J].Nature, 2008, 455(7213):674-678.

[15]Jin L, Hill KK, Filak H, et al.MPYS is required for IFN response factor 3 activation and typeⅠ IFN production in the response of cultured phagocytes to bacterial second messengers cyclic-di-AMP and cyclic-di-GMP[J].J Immunol, 2011, 187(5):2595-2601.

[16]Holm CK, Paludan SR, Fitzgerald KA.DNA recognition in immunity and disease[J].Curr Opin Immunol, 2013, 25 (1):13-18.

[17]McWhirter SM, Barbalat R, Monroe KM, et al.A host type Ⅰinterferon response is induced by cytosolic sensing of the bacterial second messenger cyclic-di-GMP[J].J Exp Med, 2009, 206(9):1899-1911.

（本文编辑 李彩）

·综述·

Qualitative analysis of bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate of Porphyromonas gingivalis by high per-formance liquid chromatography coupled with mass spectrometry

Tan Yongmei1, Yang Xiaojun1, Du Juan2, Zhao Wanghong1, Chen Xiaodan3, Hou Jin1.(1.Dept.of Stomatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;2.Hygiene Detection Center, School of Public Health and Tropical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;3.Dept.of Stomatology, The Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

[Key words]bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate;Porphyromonas gingivalis;high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry

[Abstract]Objective To test whether Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) could produce bacterial signal molecule, bis-(3’-5’)-cyclic dimeric adenosine monophosphate (c-di-AMP) and lay the foundation for explorations of its roles in life metabolism and periodontitis immunity of P.gingivalis.MethodsP.gingivalis standard strain ATCC33277 was used as the experimental strain to extract nucleic acids from the bacteria.Then, c-di-AMP was detected using high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS).Subsequently, HPLC was used to validate the sample further.ResultsBased on the signal/noise (S/N) for 3∶1, the limit of determination of HPLC-MS/MS for peak time of c-di-AMP standard substances was 7.49 min and nucleic acid extractions from P.gingivalis was 8.82 min (S/N>3).Further confirmation of HPLC showed that nucleic acid extractions from both P.gingivalis and c-di-AMP standard substances presented goal absorbent peaks at 15.7 min, with the same ultraviolet absorbent spectrum.ConclusionThe nucleic acid extractions from P.gingivalis contained c-di-AMP, which shows that P.gingivalis could produce c-di-AMP.

[中图分类号]R 780.2

[文献标志码]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.018

[收稿日期]2015-10-16； [修回日期]2016-02-18

[基金项目]国家自然科学基金（81500870）；南方医科大学南方医院院长基金（2013Z006，2012C005）

[作者简介]谭咏梅，硕士，E-mail：yobecute@126.com

[通信作者]侯晋，讲师，博士，E-mail：houjin@smu.edu.cn