UPLC—MS/MS法测定鸡蛋、鸡肉中4种氟喹诺酮类药物残留

门婷婷+刘晨+刘珂飞

摘 要：建立鸡肉和鸡蛋中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星残留检测的UPLC-MS/MS方法。样品采用2%甲酸乙腈溶液两部提取之后氮吹的方法，HESI源正离子模式扫描，在选择反应监测模式（SRM）下进行特征母-子离子对信号采集。根据保留时间和母离子及两个特征子离子信息进行定性分析，9 min内完成4种氟喹诺酮沙星类药物的定量分析。结果显示，方法检测底限为0.5 μg·kg-1，在10，20，40 μg·kg-1添加水平下，鸡肉加标回收率在70%～90%，鸡蛋加标回收率在80%～100%，且两种样本RSD值均<10%。该方法前处理简便快速，分析速度快，灵敏度高。

关键词：氟喹诺酮类药物；超高效液相-串联质谱法；鸡蛋；鸡肉

中图分类号：S859.84 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.009

Abstract： The paper established the UPLC-MS/MS method to determine the residues of norfloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，ofloxacin in the chickens and eggs. The samples were extracted by 2%formic acid in acetonitrile for two times and blow dry through termovap sample concentrator. The samples was positive ion mode scanning by heated electro spray ionization（HESI）， and the signal collection of characteristic maternal ions and sub-ion pairs was conducted by the selective reaction monitor（SRM）. The qualitative analysis was conducted on the basis of retaining time， maternal ions and the two characteristic sub-ion， and the quantitative analysis of chloramghenicol was conducted in 9 minutes. On the condition that the detection limit was 0.5 μg·kg-1 and 10，20，40 μg·kg-1 addition level， the recovery rate in chickens and eggs was 70%～90% and 80%～100% respectively， and the RSD between the two kinds of samples was less than 10%. The methods had the advantage of simple and fast on the pretreatment， quick analysis and high sensitivity.

Key words： fluoroquinolones drug； UPLC-MS/MS； chicken； eggs

氟喹諾酮类抗生素是一类人畜通用的药物。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治[1]。由于氟喹诺酮类药物在动物机体组织中的残留，人食用动物组织后氟喹诺酮类抗生素就在人体内残留蓄积，易造成人体疾病对该药物的严重耐药性，影响人体疾病的治疗，从而影响该类药物的临床疗效[2]。因此，氟喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。目前，有多种检测氟喹诺酮类药物残留的方法[3-7]，其中包括液相色谱-串联质谱法、酶联免疫试剂盒、气相色谱法、毛细管电泳法等。本研究建立了检测鸡蛋和鸡肉中4种常见氟喹诺酮类药物的多残留检测方法，采用超高效液相串联质谱法，能简便、快速地对鸡肉和鸡蛋进行定量分析检测。

1 材料和方法

1.1 仪 器

超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪：Thermofisher Dionex Ultimate 3000 RSLC - TSQ QUANTUM ACCESS MAX，配有电喷雾离子源（HESI源）；瑞宁微量移液器；VDRTEX-5-H106漩涡混合器（江苏其林贝尔）；GL-20G-II高速冷冻离心机（上海安亭）；TTL-DCI氮吹仪（北京同泰联）；超纯水仪（MILLIPORE Synergy）

1.2 药品和试剂

诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星标准品购于中国兽医药品监察所。乙腈、甲酸、正己烷为色谱纯，购于美国Thermofisher公司，试验用水由 MILLIPORE Synergy制得。

1.3 检测条件和方法

1.3.1 液相色谱与质谱条件 液相色谱柱：Hypersil Gold-C18，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；流动相，0.1%甲酸水-甲醇；流速0.35 mL·min-1；进样量，10 μL。流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸水；0～1.5 min，A为10%，B为90%；1.5～5.5 min，A由10%变化至90%，B由90%变化至10%；5.5～7 min ，A为90%，B为10%；7～9 min，A为10%，B为90%。

质谱扫描方式：正离子扫描，检测方式，多反应监测；电喷雾电压，3 800 V；雾化温度，400 ℃；辅助气流速10 arb ；鞘气流速，35 arb；毛细管温度，350 ℃。质谱采集参数见表1。

1.3.2 标准品溶液的制备 精密称取4种沙星类标准品10 mg，加乙腈至100 mL，制成100 μg·mL-1的溶液，做为标准品储备液，-4 ℃冰箱保存。储备液继续用流动相初始溶液稀释成100 ng·mL-1，做为对照工作液使用。

1.3.3 样品提取和净化 前处理过程：准确称取鸡肉、鸡蛋粉碎样品5 g（精确至0.01 g），置于50 mL具塞聚四氟乙烯离心管中，准确加入10 g预先灼烧后的无水硫酸钠，并用玻璃棒搅匀，然后加入20 mL2%甲酸乙腈。用玻璃棒混匀均质提取5 min，5 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液置于离心管中，另取20 mL 2%甲酸乙腈到另一50 mL离心管中，并清洗玻璃棒，清洗液倒入第一个离心管中对鸡肉进行重复提取，合并两次提取液并涡旋混匀。

净化过程：将前处理提取液取出8 mL在55 ℃下氮吹吹干，加入2 mL流动相初始溶液进行涡动溶解，溶解后加入1 mL10%甲醇饱和的正己烷涡旋混合30 s，8 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，用10%甲醇饱和的正己烷重复净化2～3次，直至下层透明清亮，取出下层过0.2 μm有机滤膜置2 mL样品瓶中供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的选择

2.1.1 流动相条件的选择 本试验对比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作为流动相进行对比选择。结果表明，有甲酸存在的流动相体系对氟喹诺酮类抗生素具有较好的分离能力且对出峰时产生的拖尾现象有较好的改善，证明流动相中加入甲酸能提高质谱的检测灵敏度，增加样品离子化效率。在对甲醇和乙腈的选择上，考虑到试剂本身的性价比问题，流动相体系选择甲醇-0.1%甲酸水就完全可以满足试验的要求。在流动相比例调整过程中发现，在流动相短时间内变化比较大的情况下，出峰峰形效果越好，对峰形的毛刺、拖尾的现象越有明显改善，在计算峰形面积时，不经过平滑即可得到可靠的数据。

2.1.2 质谱条件的选择 对4种沙星进行质谱条件优化，在正离子模式条件下得到最佳离子碰撞能量和Tube Lens值。在电喷雾电压、雾化温度、辅助气流和毛细管温度等质谱参数的不同变化的情况下，比较样品出峰情况和信号响应值，最终得到最佳条件分别为电喷雾电压3 800 V；雾化温度400 ℃；辅助气流速10 arb ；鞘气流速35 arb；毛细管温度350 ℃。具体TIC图见图1。

2.2 标准曲线线性考察

取适量标准储备液，用流动相初始溶液对4种沙星标准储备液进行混合并稀释成系列浓度为0.5，1，2，4，8 ng·mL-1的标准工作液，从低浓度到高浓度进行测定，每一浓度进样3针，按其所得峰面积与相应标准工作液的浓度作标准曲线（表2），并依次计算回归方程及相关系数，最后绘制标准曲线。

2.3 添加回收和精密度试验

准确量取100，200，400 μL对照工作液加入到5 g样品中，每个添加浓度制备3份平行样，每份样品进样3次，取平均值。核算9个回收率测定结果并计算相对标准偏差（RSD）。

由表3知：鸡肉中4种氟喹诺酮抗生素阳性添加样品的回收率普遍在70%～90%，批間内变异系数均<10%；鸡蛋中4种氟喹诺酮抗生素阳性添加样品的回收率普遍在80%～100%，批间内变异系数均<10%。向实际样品添加氟喹诺酮抗生素标样来确定本方法的检测底限，考虑到样品基质的干扰性及信噪比要求，经试验数据确定本方法的检测底限（LOQ）为0.5 μg·kg-1。

3 结 论

本文建立了测定鸡蛋、鸡肉中氟喹诺酮类药物残留的UPLC-MS/MS方法。通过样品前处理以及仪器的各项参数的优化，找出了最佳的样品提取方法，并使仪器检测灵敏度达到最优化。该方法的检测底限（LOQ）为 0.5 μg·kg-1，同时样品前处理时省去了净化过程，具有处理程序简单、快速、测定准确率高等特点。

参考文献：

[1]KNG K J， RIOND J L， WANNER M. Pharmacokinetics of enrofloxacin and its metabolite dproflozadn after intravenous and oral administration of Baytril in dogs[J]. Journal of veterinary pharmacology and therapeutics， 1994， 16（4）：462-468.

[2]丁国华， 丁磊如， 刘霞. 氟喹诺酮类药的神经毒性作用[J]. 中国医院药学杂志， 1995（8）：380-381.

[3]SCHNEIDER M J.Multiresidues determination of fluoroquinolones in eggs[J].Journal of AOAC internation，2000，83：6.

[4] 谢恺舟.兽药残留分析方法[J].中国家禽，2001，23（17）：5-7.

[5] 刘明生，甘辉群，谭菊，等.高效液相色谱法同时测定鸡蛋中恩诺沙星和环丙沙星的残留[J].饲料工业，2007，28（21）：39-40.

[6]李海燕，李小薇，李娜，等.鸡蛋中9种氟喹诺酮类药物多残留检测方法的建立及甲磺酸培氟沙星在鸡蛋中的消除研究[J].中国兽医杂志，2008，44（5）：84- 85.

[7] 中华人民共和国山东出入境检验检疫局. 动物源产品：GB/T 20366—2006[S].北京：中国标准出版社，2006.