茶条槭叶总酚的提取工艺优化及其抗氧化活性

赵　岩，于　婷，蔡恩博，刘双利，杨　鹤，张连学

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)



茶条槭叶总酚的提取工艺优化及其抗氧化活性

赵岩，于婷，蔡恩博，刘双利，杨鹤，张连学

(吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118)

[摘要]【目的】 研究茶条槭叶总酚的提取工艺，并对茶条槭叶总酚提取物的抗氧化活性进行评价，为茶条槭叶的开发利用提供依据。【方法】 以乙醇为溶剂, 以总酚提取率为考察指标，采用超声辅助提取法处理茶条槭叶，先通过单因素试验确定乙醇体积分数、超声提取时间和液固比的适宜范围，再应用中心组合设计和响应面分析相结合的方法筛选最佳提取条件；最后采用铁离子还原法、DPPH自由基清除法测定茶条槭叶提取物的抗氧化能力。【结果】 超声波辅助提取茶条槭叶总酚的最佳工艺条件为：乙醇体积分数55%，超声提取时间46 min，液固比246 mL/g，在此条件下茶条槭叶总酚提取率为 (10.95±0.22)%。茶条槭叶总酚提取液对铁离子还原的IC50为 (0.157±0.005) mg/mL，对DPPH自由基的IC50为 (0.073±0.003) mg/mL。【结论】 超声提取法可以避免总酚在较高温度下的分解，且优化后提取率较高，可以用于茶条槭叶总酚的提取；茶条槭叶提取液具有较高的抗氧化活性。

[关键词]茶条槭叶；总酚；超声提取；中心组合设计；响应面分析；抗氧化活性

茶条槭(AcerginnalaMaxim)为槭树科槭树属的落叶灌木或小乔木，主要分布在中国、朝鲜、日本、俄罗斯、蒙古等国[1]。茶条槭树形优美，枝叶浓密，秋叶猩红色，因此是优良的园林绿化树种[2]；从茶条槭叶中可提取没食子酸[3-4]，其嫩叶还可制成茶叶，具有生津止渴、退热明目之功效[5]，因此茶条槭还具有较大药用价值和经济价值[6]。

植物酚酸类物质广泛存在于植物组织中[7]，许多研究资料显示，总酚具有较强的抗氧化活性及明显的抑菌、抑肿瘤、抗衰老和抗心血管疾病的作用[8-10]。许多学者对植物中的酚类化合物进行了研究[11-16]，但有关茶条槭叶中总酚提取方法及其抗氧化活性的研究却鲜有报道。为此，本研究拟采用响应面分析法[17-19]对茶条槭叶中总酚的提取工艺进行优化，并测定其体外抗氧化能力[20-21]，旨在为茶条槭叶的开发利用提供理论依据和技术支持。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料供试茶条槭叶采自吉林农业大学药用植物园，阴干粉碎后过孔径0.18 mm(80目)筛备用。没食子酸为北京百灵威科技有限公司产品，福林酚试剂为合肥博美生物产品，1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)为上海源叶生物科技有限公司产品，其他试剂均为分析纯。

1.1.2主要试验仪器港威超声仪，超声频率40 kHz，超声功率2 000 W，由江苏省张家港市港威超声电子有限公司生产；LD-34流水式中药粉碎机，由中国温岭市大海药材器械厂生产；百灵LA114型电子天平，由常熟市百灵天平仪器有限公司生产；UV-1800紫外可见分光光度计，由上海美谱达仪器有限公司生产；HH-W-600型数显恒温水箱，由金坛市江南仪器厂生产。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备取没食子酸适量，精密称定，加蒸馏水制成0.25 mg/mL的溶液。

1.2.2供试品溶液的制备取同一批次的茶条槭叶0.5 g，精密称定，按一定的液固比加入一定体积分数的乙醇-水溶液，超声提取一定时间，过滤，作为供试品溶液。

1.2.3总酚含量的测定采用比色法测定茶条槭叶提取液中的总酚含量：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加入福林酚试剂2.5 mL、碳酸钠溶液(75 g/L)2 mL，于50 ℃水浴加热5 min，冷却后用蒸馏水定容。然后在760 nm处测定吸光度值。运用外标一点法计算茶条槭叶总酚含量(提取率)。

1.2.4茶条槭叶总酚提取的单因素试验采用超声辅助提取法提取茶条槭叶总酚，考察乙醇体积分数(0，20%，40%，60%，80% 和 95%)、超声提取时间(5，10，20，30，40 和 50 min)、液固比(20，50，100，150，200，250和300 mL/g)3个因素对茶条槭叶总酚提取率(同1.2.3节的总酚含量)的影响。

1.2.5茶条槭叶总酚提取的中心组合设计试验为了分析各因素及其交互作用对茶条槭叶中总酚提取率的影响，得到最佳提取工艺，在单因素试验结果的基础上，以茶条槭叶中总酚提取率为指标，进行了中心组合设计试验。中心组合设计试验中各因素及其水平详见表1。

表 1　提取茶条槭叶总酚的中心组合设计试验的因素与水平

1.2.6数据统计分析采用SAS 9.1.3软件对试验结果进行响应面分析，建立数学模型，用岭脊分析优化提取工艺，并采用ORIGIN 8软件作图。

1.2.7茶条槭叶总酚的抗氧化活性评价(1)对铁离子的还原能力。采用比色法测定茶条槭叶总酚对三价铁离子的还原能力。将提取液(响应面最优条件下)稀释成6个质量浓度梯度(0.005～1 mg/mL)的样品溶液，每个梯度分别取样品溶液2.5 mL，加入2.5 mL pH 6.6磷酸盐缓冲液(0.2 mol/mL)和2.5 mL 质量分数1% K3Fe(CN)6，混合均匀，于50 ℃反应20 min，放凉，再加入2.5 mL 质量分数10%三氯乙酸。从上述混合液中取出2.5 mL放入新的刻度试管中，加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 质量分数0.1% FeCl3，用体积分数95%乙醇作为空白对照，在700 nm处测量吸光度值。对照品选用2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、维生素C(Vc)。运用ORIGIN 8软件计算半抑制率(IC50值)。

(2)DPPH自由基的清除能力。采用比色法[22]测定茶条槭叶总酚对DPPH·的清除作用。将提取液(响应面最优条件下)稀释成6个质量浓度梯度(0.005～1 mg/mL)的样品溶液。向a具塞试管中加入3 mL DPPH·溶液(0.04 mg/mL)、3 mL体积分数95%乙醇溶液，向b具塞试管中加入3 mL DPPH·溶液(0.04 mg/mL)、3 mL不同质量浓度(1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005 mg/mL)样品溶液，向c具塞试管中加入3 mL不同质量浓度样品溶液(与b具塞试管一一对应)、3 mL体积分数95%乙醇溶液，摇匀，室温避光静置30 min，用体积分数95%乙醇作参比溶液，在515 nm 处测量吸光度值。对照品选用BHT、Vc。样品对DPPH·的清除率(E)按如下公式计算。运用ORIGIN 8软件计算IC50值。

式中：Aa是a具塞试管的吸光度值，Ab是b具塞试管的吸光度值，Ac是c具塞试管的吸光度值。

2结果与分析

2.1提取茶条槭叶总酚的单因素试验

2.1.1乙醇体积分数对提取率的影响固定超声提取时间为30 min，液固比为200 mL/g，乙醇体积分数对茶条槭叶总酚提取率的影响结果见图1。由图1可知，在乙醇体积分数为0～60%时，随着乙醇体积分数的增加，茶条槭叶总酚提取率随之增加，乙醇体积分数为60%时，总酚提取率最高；继续增加乙醇体积分数，总酚提取率有所下降。考虑到实际生产中乙醇回收的耗能问题，尽可能选择高体积分数乙醇进行提取，因此将乙醇体积分数考察范围定为20%～80%。

2.1.2超声提取时间对提取率的影响固定乙醇体积分数为60%，液固比为200 mL/g，超声提取时间对茶条槭叶总酚提取率的影响结果见图2。由图2可知，在超声提取时间为5～40 min时，随着超声提取时间的延长，茶条槭叶总酚提取率随之提高，在40 min之后总酚提取率有所下降，因此将超声提取时间考察范围定为20～50 min。

图 1　乙醇体积分数对茶条槭叶总酚提取率的影响

2.1.3液固比对提取率的影响固定乙醇体积分数为60%，超声提取时间为30 min，液固比对茶条槭叶总酚提取率的影响结果见图3。由图3可知，在液固比为20～200 mL/g时，随着液固比的增加，茶条槭叶总酚提取率随之提高；从200 mL/g至300 mL/g时，总酚提取率先保持平稳后略微下降，因此将液固比考察范围定为100～300 mL/g。

图 3　液固比对茶条槭叶总酚提取率的影响

2.2提取茶条槭叶总酚的中心组合设计-响应面分析

2.2.1试验方案及其结果提取茶条槭叶总酚的中心组合设计试验方案及其结果详见表2，共进行了17组独立试验。

2.2.2响应面分析采用SAS 9.1.3软件的RSREG(二次响应面回归模型)程序对表2中的试验结果进行响应面分析，经二次回归拟合，得到回归模型参数估计值(表3)、方差分析表(表4)和岭脊分析表(表5)。由表3可知，回归方程为：

从表4可见，总模型、线性项、平方项的P<0.01，表明总模型和方程的线性项、平方项对总酚提取率的影响极显著；而方程的交互项P>0.05，表明其对提取率的影响不显著。相关性分析中，总模型的相关系数R2=0.911 0，表明回归方程对总酚提取率的预测值与实测值有较好的相关性。失拟项检验中，P>0.05，表明失拟性不显著，该回归方程无失拟因素存在，回归方程与实测值能较好拟合。

表 2　提取茶条槭叶总酚的中心组合设计试验方案及其结果

对回归方程的岭脊分析结果(表5)表明，方程预测的茶条槭叶中总酚最佳提取条件为：乙醇体积分数55%，超声提取时间46 min，液固比246 mL/g；在该条件下，总酚的提取率为11.02%。为验证模型的有效性，对上述最佳提取条件进行了验证试验，结果平均提取率为(10.95±0.22)%，试验值与预测值接近。进一步说明模型的可行性。

为了更直观地体现各因素对茶条槭叶总酚提取率的影响，运用ORIGIN 8 软件绘制响应面图形，结果见图4～6。

从图4可以看出，当液固比不变时，总酚提取率随着超声提取时间的增加呈先略微升高后下降的趋势；当超声提取时间不变时，总酚提取率随着液固比的增加呈现先升高后平缓下降的趋势。从等高线图和响应面的角度可以判断出，液固比对响应值的影响大于超声提取时间。

表 3　提取茶条槭叶总酚的中心组合设计-响应面分析回归模型中回归系数的显著性检验结果

注：*P<0.05，表示显著；**P<0.01，表示极显著；在P<0.2水平上拒绝假设。下同。

Note:*P<0.05,significant;**P<0.01,very significant;assumption was rejected inP<0.2 level.The same below.

表 4　提取茶条槭叶总酚的中心组合设计-响应面分析回归模型的方差分析

表 5　提取茶条槭叶总酚的中心组合设计-响应面分析回归模型的岭脊分析

从图5可以看出，当液固比不变时，总酚提取率随着乙醇体积分数的增加呈先上升后下降的趋势；当乙醇体积分数不变时，总酚提取率随着液固比的增加呈先上升后平缓下降的趋势。从等高线图和响应面的角度可以判断出，液固比对响应值的影响略大于乙醇体积分数。

从图6可以看出，当超声提取时间不变时，总酚提取率随着乙醇体积分数的升高呈现先升高后下降的趋势；当乙醇体积分数不变时，总酚提取率随着超声提取时间的增加呈先升高后略微下降的趋势。从等高线图和响应面的角度可以判断出，乙醇体积分数对响应值的影响略大于超声提取时间。

综上所述，液固比对总酚得率的影响最大，乙醇体积分数次之，超声提取时间的影响较小。

图 4　超声提取时间和液固比对茶条槭叶总酚提取率影响的等高线图(左)和

图 5　乙醇体积分数和液固比对茶条槭叶总酚提取率影响的等高线图(左)和

图 6　乙醇体积分数和超声提取时间对茶条槭叶总酚提取率影响的等高线图(左)和

2.3茶条槭叶总酚的抗氧化能力

2.3.1对铁离子的还原能力三价铁离子在700 nm处有最大吸收峰，当抗氧化剂与Fe3+在pH 6.6的条件下反应还原成Fe2+，溶液由黄色转化为绿色，且其颜色转化程度越深表示抗氧化能力越强，因而可用比色法进行定量分析，从而评价样品的抗氧化能力。由图7可知，茶条槭叶提取液(响应面最优条件下)对三价铁离子具有很强的还原能力，其还原能力随提取液质量浓度的增加而不断增强，IC50为(0.157± 0.005) mg/mL。在质量浓度均为0.157 mg/mL时，其铁离子还原能力分别是BHT、Vc的42.0%和52.7%。

2.3.2对DPPH自由基的清除能力DPPH 自由基在515 nm处有最大吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，当存在有自由基清除能力的抗氧化剂时，由于抗氧化剂与DPPH·的单电子配对，继而使其吸收逐渐消失，且其褪色程度与接受的电子数成定量关系，因而可用比色法进行定量分析来检测自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力[23]。由图8可知，茶条槭叶提取液(响应面最优条件下)对DPPH自由基具有很强的清除作用，在较低的质量浓度下即有较高的清除效果，且随提取液质量浓度的增加而不断增强，IC50为 (0.073±0.003) mg/mL。在质量浓度均为0.073 mg/mL时，其清除DPPH自由基的能力分别是BHT、Vc的14.5%和44.3%。

图 7　茶条槭叶总酚对铁离子的还原作用

3结论

本试验在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化茶条槭叶总酚的提取工艺，结果表明，液固比对总酚得率的影响最大，乙醇体积分数次之，超声提取时间的影响较小，最佳工艺条件为: 液固比246 mL/g，乙醇体积分数55%，超声提取时间46 min。验证试验结果表明，茶条槭叶总酚的得率为(10.95±0.22)%，回归模型拟合度高，可用于优化茶条槭叶总酚的提取工艺条件，具有实用价值。

本试验通过对茶条槭叶总酚提取液(响应面最优条件下)抗氧化性的研究表明：茶条槭叶原药材具有较强的抗氧化能力，茶条槭叶总酚提取液对铁离子还原力的IC50为(0.157±0.005) mg/mL，对DPPH自由基的IC50为(0.073±0.003) mg/mL。由于茶条槭叶的总酚含量较高，有较好的抗氧化能力，且为天然提取物，使用安全，因此可以作为新型的抗氧化剂，具有较好的开发潜力。

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Optimization of total phenol extraction from leaves ofAcerginnalaand its antioxidant activity

ZHAO Yan,YU Ting,CAI En-bo,LIU Shuang-li,YANG He,ZHANG Lian-xue

(CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This paper investigated the extraction process of total phenol from Acer ginnala leaves and evaluated its antioxidant activity to provide basis for the development and utilization of A.ginnala leaves.【Method】 A.ginnala leaves were processed using ultrasonic assisted method with ethanol as the solvent and total phenol extraction yield as examining index.First,ethanol volume fraction,suitable range of ultrasonic extraction time,and solid-liquid ratio were determined by single factor experiments.Then,central composite design and response surface analysis method were applied for screening the best extraction conditions.At last,the iron reduction method and DPPH free radical scavenging assay were adopted to determine antioxidant capacity of A.ginnala leaves extract.【Result】 The optimum conditions for ultrasonic assisted extraction were ethanol volume fraction 55%,extraction time 46 min,and liquid-solid ratio 246 mL/g with the optimal total phenol yield of (10.95±0.22)%.The iron ions reduction IC50of extract was (0.157±0.005) mg/mL and that for DPPH was (0.073±0.003) mg/mL.【Conclusion】 Ultrasonic extraction method can avoid the decomposition of total phenol under high temperature,and had high yield after optimization.Thus,it can be used for extraction of total phenol from A.ginnala leaves,which had high antioxidant activity.

Key words:leaves of Acer ginnala;total phenolic;ultrasonic extraction;central composite design;response surface analysis;antioxidant activity

[文章编号]1671-9387(2016)01-0177-08

[中图分类号]R284.2

[文献标志码]A

[作者简介]赵岩(1979-)，男，吉林长春人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事天然药物化学成分与生物活性研究。[通信作者]张连学(1955-)，男，吉林长春人，教授，博士生导师，主要从事药用植物栽培与加工研究。E-mail：zlx863@163.com

[基金项目]国家科技支撑计划项目(2011BAI03B01)；国家公益性行业科研专项(201303111)；吉林省科技发展计划项目(20126046,YYZX201258,20140204013YY)；国家自然科学基金项目(31000154)

[收稿日期]2014-04-15

DOI：网络出版时间:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.026

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.052.html

E-mail：zhyjlu79@163.com