麒麟尾总黄酮提取及其抗氧化作用研究

罗泽萍++潘立卫

摘要：利用单因素试验及正交试验法考察麒麟尾（Epipremnum pinnatum）总黄酮提取的最佳工艺，并通过测定总黄酮对羟基自由基（·OH）和2，2-二（4-叔辛基）-1-苦肼基自由基（DPPH·）的清除作用研究其抗氧化性。结果表明，麒麟尾总黄酮提取的最佳工艺条件为超声时间35 min、超声温度90 ℃、料液比1∶15（g∶mL）、乙醇体积分数85%，在此条件下总黄酮得率为3.04%；抗氧化试验结果表明，麒麟尾总黄酮具有较强的抗氧化活性，对·OH和DPPH·自由基的IC50分别为2.355和0.143 mg/mL。

关键词：麒麟尾（Epipremnum pinnatum）；总黄酮；提取工艺；抗氧化活性

中图分类号：S567.7+9；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4783-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.037

黄酮类化合物广泛存在天然植物中，其具有多方面的药理活性，如可以改善糖和脂代谢从而起到降血糖[1]、降血脂[2]的作用，还可以通过改善循环系统起到保护心肌[3]、降血压[4]和抗心律失常[5]等作用，其他药理作用还有保护肝脏[6]、镇痛抗炎[7]、抗血栓[8]、抗氧化[9]和抗肿瘤[10]等。因此，研究和开发植物总黄酮成分和药理活性具有重要意义。麒麟尾（Epipremnum pinnatum）药性平、味苦、微辛，具有敛疮排脓、舒筋活血、消肿止痛、清热解毒等功效，主要用于感冒发热、鼻衄、目赤肿痛、百日咳、跌打损伤、骨折、风湿痹痛、痰火瘰疬、痈疖、毒蛇咬伤等[11，12]。目前，对麒麟尾的研究主要集中在园林景观、资源分布和抗癌活性等[13-16]。基于麒麟尾有着良好的民间药用基础，而其药理活性和化学成分的研究甚少，对总黄酮提取工艺和抗氧化活性的研究鲜见报道。本试验以单因素试验及正交试验法考察麒麟尾总黄酮的提取工艺，并探讨其总黄酮的抗氧化作用。旨在为深入研究和开发麒麟尾植物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

麒麟尾采自广西宜州市郊区，经河池学院邓晰朝副教授鉴定为天南星科麒麟叶属麒麟尾。芦丁标准品由河池学院化学与生物工程学院制药工程实验室提供，经HPLC检测，芦丁含量>99%；DPPH由美国Sigma公司提供，其余试剂均为国产分析纯。

主要仪器设备：紫外可见分光光度计（美国Agilent公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；电子恒温水浴锅（北京泰克仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制 配置芦丁标准品溶液（含芦丁0.20 mg/mL），精密吸取芦丁标准品溶液0（空白）、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于10 mL容量瓶中，分别加入6、5、4、3、2、1 mL 70%乙醇，吸取0.3 mL亚硝酸钠溶液（5%）加入容量瓶，轻轻摇匀，室温静置10 min，吸取0.3 mL三氯化铝溶液（10%）加入容量瓶，轻轻摇匀，室温静置10 min，吸取2 mL氢氧化钠（1 mol/L）溶液加入容量瓶后用70%乙醇定容至刻度，轻轻摇匀，室温静置10 min后测定吸光度（图1），得回归方程为y=0.402 5x+0.002 2（r2=0.999 1）。

1.2.2 总黄酮含量测定流程 麒麟尾洗净沥干→60 ℃下烘干→粉碎，过40目筛→称取1.00 g→不同超声时间、超声温度、料液比和乙醇体积分数进行提取→过滤，收集滤液→用无水乙醇定容至50 mL→移取1 mL→按“1.2.1”的方法测定吸光度→从回归方程算得总黄酮含量→根据称取的样品量、稀释倍数计算样品中总黄酮的得率。

1.2.3 正交试验 先对麒麟尾总黄酮得率影响较大的超声时间、超声温度、料液比（g∶mL，下同）、乙醇体积分数进行单因素试验。在单因素试验的基础上，进行正交试验，因素与水平见表1。

1.2.4 总黄酮对·OH清除能力测定 在邻二氮菲-金属铁离子-H2O2为反应体系下进行试验。具体操作如下：取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 5个不同浓度的麒麟尾总黄酮溶液于刻度试管中，分别加入0.5 mL FeSO4（7.5 mmol/L）、0.75 mL邻二氮菲（5.0 mmol/L）。再加入0.5 mL双氧水（0.1%）后，用蒸馏水稀释至5 mL刻度，把试管放入37 ℃水浴恒温60 min，用紫外分光光度仪测定吸光度A1（536 nm），并设立空白组A2（蒸馏水代替样品）和样底组A0（蒸馏水代替双氧水），重复3次，求平均值，以维生素C作为对照。清除·OH自由基计算公式：

清除率=（1-■）×100%

1.2.5 总黄酮对DPPH·自由基清除能力测定 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 5个不同浓度的麒麟尾黄酮溶液0.5 mL于刻度试管中，加入2 mL DPPH（0.1 mmol/L）溶液后用蒸馏水稀释至4 mL，轻轻摇匀，于37 ℃水浴恒温静置30 min，用紫外分光光度仪测定吸光度A2（520 nm），并设立样底组A1（无水乙醇代替DPPH·溶液）和空白组A0（蒸馏水代替样品溶液），重复3次，求平均值。测定结果以同等条件下的维生素C为对照，清除DPPH·自由基计算公式：

清除率=（1-■）×100%

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声时间 选择超声温度为70 ℃、料液比1∶15和65%乙醇，以超声时间对麒麟尾总黄酮得率做单因素试验（图2）。由图2可知，超声时间为15 min时麒麟尾总黄酮得率很少，可能是超声时间短，总黄酮还没完全被提取出来，当超声时间过了35 min后，总黄酮得率开始下降，说明有效成分已经基本被提取出来，所以总黄酮得率不再增加。

2.1.2 超声温度 选择1∶15的料液比、65%的乙醇，固定超声35 min，以超声温度对麒麟尾总黄酮做单因素试验（图3）。由图3可知，在80 ℃之前，超声温度增加，总黄酮得率上升，成正相关关系，90 ℃比80 ℃黄酮得率低，说明温度过高，会对总黄酮的有效成分结构造成破坏，所以总黄酮得率不再增加。

2.1.3 料液比 固定超声时间35 min、温度80 ℃，选择65%乙醇，以料液比对麒麟尾总黄酮做单因素试验（图4）。由图4可知，随着溶剂增加，总黄酮得率先升后降，料液比1∶20总黄酮得率最理想，说明该料液比有效成分提取已比较充分，不需要继续增加提取液从而避免增加浓缩的时间和浪费提取液。

2.1.4 乙醇体积分数 固定超声时间35 min、温度80 ℃和料液比1∶20，以乙醇体积分数对麒麟尾总黄酮做单因素试验（图5）。由图5可知，55%～95%的乙醇，总黄酮得率最高的是75%，说明75%乙醇溶出总黄酮的含量最高。

2.2 正交试验结果

对超声时间、超声温度、料液比和乙醇体积分数分别取3个水平进行正交试验。正交试验结果（表2）显示，各因子对麒麟尾总黄酮得率均有影响，其大小顺序为A>B>D>C，可见超声时间是总黄酮得率的关键性因子。根据正交试验结果得出最佳的麒麟尾总黄酮提取工艺组合为A2B3C1D3，取3次验证试验得A2B3C1D3总黄酮得率为3.04%。麒麟尾总黄酮提取最佳组合为超声时间35 min、超声温度90 ℃、料液比1∶15、乙醇体积分数85%。

2.3 麒麟尾总黄酮对·OH的清除能力

结果显示麒麟尾总黄酮有一定的清除·OH活性，其IC50为2.355 mg/mL。由图6可知，麒麟尾总黄酮浓度越大，对·OH清除率越高，可见两者存在良好的剂量效应关系，但清除·OH活性比同浓度的维生素C弱。

2.4 麒麟尾总黄酮对DPPH·自由基的清除能力

由图7可知，麒麟尾总黄酮在低浓度下对DPPH·自由基有清除作用，其IC50为0.143 mg/mL，总黄酮溶液浓度增加，对DPPH·清除率越高，可见两者成正相关关系。根据IC50可判断，麒麟尾总黄酮DPPH·自由基清除能力>·OH自由基清除能力，但对两种自由基的清除作用均弱于维生素C，可能是由于麒麟尾总黄酮中的抗氧化活性物质纯度比不上维生素C。

3 结论

总黄酮的提取方法有很多，如乙醇回流提取法、超声提取法、微波提取法、超临界提取法和超滤法等[17]，其中超声提取法提取时间短、节约溶剂、提取完全，并且超声提取在低温下提取效果也很好。本试验在单因素基础上，结合超声辅助提取，对超声时间、超声温度、料液比和乙醇体积分数分别取3个水平进行正交试验，优化麒麟尾总黄酮的最佳工艺。结果发现，超声时间是总黄酮得率的关键性因子，麒麟尾总黄酮提取的最佳工艺条件为：超声时间35 min、超声温度90 ℃、料液比1∶15、乙醇体积分数85%，在此条件下总黄酮得率为3.04%。该方法稳定性好、省时、高效及节能。陈玉霞等[18]采用DPPH法研究41种中草药抗氧化活性取得良好效果，认为这种方法评价药物体外抗氧化作用不需要昂贵的仪器并且原理明确、操作简便、易标准化。因DPPH法、清除·OH自由基法操作简单快速，所以在实验室应用得比较广泛。本试验通过测定麒麟尾总黄酮对DPPH·、·OH自由基的清除作用，评价其抗氧化活性，结果发现麒麟尾总黄酮清除自由基能力较强，可有效清除DPPH·、·OH自由基并呈现良好的剂量效应关系，对·OH和DPPH·自由基的IC50分别为2.355和0.143 mg/mL。本研究可为深入研究麒麟尾总黄酮抗氧化作用机制与合理开发利用麒麟尾植物资源提供一定的理论依据。

参考文献：

[1] 俞 浩，毛斌斌，周国梁，等.白背三七总黄酮对糖尿病大鼠的降血糖作用[J].食品科学，2013，34（15）：295-298.

[2] 雷燕妮.黄芩总黄酮对高血脂大鼠的降血脂作用研究[J].动物医学进展，2014，35（7）：64-68.

[3] 高蒙蒙.红车轴草总黄酮对氧化应激诱导的血管内皮细胞和心肌细胞损伤的保护作用及机制研究[D].北京：北京协和医学院，2013.

[4] 逄秀凤.四种天然化合物抑制肿瘤血管生成及沙棘总黄酮降血压作用的研究[D].上海：华东师范大学，2009.

[5] 何晓山，周宁娜，林 青，等.滇黄芩总黄酮抗心律失常作用的实验研究[J].中国中药杂志，2010，35（4）：508-510.

[6] 张天文.鸦葱精制总黄酮的制备及其保肝、抗乙肝病毒药理活性的研究[D].长春：吉林大学，2015.

[7] 金 岩，黄 山，赵 磊，等.松生等总黄酮提取工艺及镇痛抗炎作用研究[J].医药导报，2014，33（11）：1411-1415.

[8] 叶 勇，欧贤红，黄秋洁，等.藤茶总黄酮及黄酮醇类化合物的抗血栓作用研究[J].中药新药与临床药理，2013，24（1）：33-36.

[9] 吴晓宁，余陈欢，徐静红.乌蕨总黄酮体外抗氧化活性的研究[J].医药导报，2010，29（3）：292-294.

[10] 王 敏，贾正平，马 骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用[J].中国中药杂志，2005，30（8）：603-606.

[11] 中国科学院北京植物研究所.中国高等植物图鉴（5）[M].北京：科学出版杜，1976.

[12] 吴征镒.云南植物志[M].北京：科学出版社，2004.

[13] 陈红伟.西双版纳的野生麒麟叶资源[J].中国野生植物资源，2001，20（2）：37.

[14] 许渝花，林利华，宗 桦，等.麒麟叶的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2009，45（1）：47-48.

[15] 黄威廉.天南星科植物族属分类及地理分布[J].贵州科学，2014， 32（1）：1-9.

[16] 肖正春.麒麟叶治疗癌症[J].中国野生植物资源，1999，18（2）：42.

[17] 赵子龙，薛培凤，倪佩东，等.天然药物中总黄酮的提取工艺研究进展[J].内蒙古包头医学院学报，2012，34（12）：513-516.

[18] 陈玉霞，刘建华，林 峰，等.DPPH法、FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索，2011，30（6）：11-14.