miRNA-181a在人肺腺癌细胞中的表达及对细胞功能的影响

赵 铎， 金 柱， 宋亚亚， 高宝安

(三峡大学呼吸病研究所，宜昌市中心人民医院呼吸科，湖北 宜昌 443003)

miRNA-181a在人肺腺癌细胞中的表达及对细胞功能的影响

赵 铎， 金 柱， 宋亚亚， 高宝安△

(三峡大学呼吸病研究所，宜昌市中心人民医院呼吸科，湖北 宜昌 443003)

目的： 研究微小RNA-181a(miRNA-181a)在不同人肺腺癌细胞中的表达及其转染人肺腺癌耐药细胞A549/DDP后对其细胞功能的影响及机制。方法: 利用实时荧光定量PCR方法检测miRNA-181a在人正常肺上皮细胞系BEAS-2B、人肺腺癌细胞系A549、人肺腺癌耐药细胞系A549/DDP中的表达；利用pGenesil-miRNA-181a真核表达质粒转染A549/DDP细胞，同时设置未转染组和空载组；分别采用实时荧光定量PCR、MTT法、流式细胞术、Transwell实验以及Western blot法检测miRNA-181a转染前后的表达情况、对A549/DDP细胞活力、细胞周期、细胞侵袭能力和顺铂(DDP)作用下的细胞生长抑制率、细胞凋亡率的影响以及对A549/DDP细胞中miRNA-181a的靶基因bcl-2和p53蛋白表达的影响。结果: miRNA-181a在A549和A549/DDP中的表达量显著低于BEAS-2B(P<0.05)，且在A549/DDP中表达量最低；miRNA-181a转染A549/DDP细胞后其表达显著升高(P<0.05)且能够抑制A549/DDP细胞活力、细胞周期和细胞侵袭能力(P<0.05)，同时升高DDP作用下A549/DDP细胞的生长抑制率和细胞凋亡率(P<0.05)；miRNA-181a转染A549/DDP细胞后抑制Bcl-2蛋白的表达而促进P53蛋白的表达(P<0.05)。结论: miRNA-181a可能参与了肺腺癌的发生发展，miRNA-181a可作为人肺腺癌治疗的新靶点。

微小RNA-181a； A549/DDP细胞系； 细胞周期； 细胞凋亡； 细胞侵袭

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由内源基因编码的长度一般为18～23个碱基构成的非编码单链RNA分子，它们在转录后能够调控目的基因的表达，参与到细胞的凋亡、增殖、分化、发育和代谢等生理过程中[1]。已有研究报道[2]，在多种肿瘤中均发现了miRNA表达量的改变，提示其可能参与到肿瘤的发病机理中，与肿瘤的生长、转移和耐药等相关，发挥促癌或抑癌基因的作用。大量研究表明[3]，miRNA的异常表达会促进肿瘤的发生和进展，在非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等多种恶性肿瘤中具有重要临床价值。miR-181a在多种组织脏器中选择性的表达，具有功能多样、生物学效应显著等特点。有研究表明[4]miR-181a能够调控癌细胞的增殖和凋亡，如在急性髓系细胞白血病细胞中过表达miR-181a会显著降低细胞的增殖和代谢活性，而抑制miR-181a表达对急性髓细胞样白血病细胞增殖和代谢活性却没有产生影响。在人恶性胶质瘤细胞U87MG对放射物的敏感性研究中，也发现辐射处理后的U87MG细胞Bcl-2发生上调，而miR-181a下调；而过表达miR-181a则会下调Bcl-2蛋白，所以调控miRNA-181a的表达对于临床治疗肿瘤具有重要的参考价值[5]。肺癌是当今肿瘤死亡的重要原因，而其中以非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)为主，这与其容易产生耐药性有关[6]。但目前对于miRNA-181a在NSCLC细胞中的表达情况尚不确定，其在NSCLC细胞增殖、侵袭、凋亡及耐药性等细胞功能中发挥的作用也未知。因此，本研究选择人肺腺癌细胞A549及耐药A549/DDP为NSCLC细胞系的研究对象，检测miRNA-181a在不同NSCLC细胞中的表达情况及对相关细胞功能的影响。

材 料 和 方 法

1 细胞株与试剂

人正常肺上皮细胞系BEAS-2B、人肺腺癌细胞系A549、人肺腺癌耐药细胞系A549/DDP购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、含0.25% EDTA的胰酶购自HyClone；TRIzol提取RNA试剂盒购自成都天根公司；NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit、OpenArray MicroRNA Real-Time PCR Master Mix购自Invitrogen；Transwell Permeable Supports购自Corning；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、顺铂(cis-diamminedichloroplatinum，DDP)购自Sigma；细胞周期检测试剂盒、Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自北京鼎国生物公司；兔抗人Bcl-2、 P53、β-actin的I抗购自Santa Cruz；HRP标记山羊抗兔IgG的II抗购自北京中杉金桥公司。

2 方法

2.1 细胞培养 分别将购买的人正常肺上皮细胞系BEAS-2B、人肺腺癌细胞系A549、人肺腺癌耐药细胞系A549/DDP细胞快速复苏后在含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。每隔12 h后更换新培养基1次，在倒置显微镜下观察细胞形态并等细胞贴壁生长至80%以上后进行细胞传代培养。将传代的细胞进行连续培养并进行后续实验。

2.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-181a的表达 分别将处于增殖期的BEAS-2B、A549、A549/DDP细胞经含0.25%的胰酶消化后，900 r/min离心5 min后收集细胞。在各组细胞中加入1 mL的TRIzol提取液，按照试剂盒步骤提取总 RNA，设计合成miRNA-181a茎环特异逆转录引物为5’-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA-CGCTCACCG-3’；利用miRNA-181a特异性引物和NCodeTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit逆转录合成cDNA第1链。由Invitrogen设计合成miRNA-181a和内参照U6实时荧光定量PCR的引物，miRNA-181a上游引物为5’-GCCGAAACATTCAACGCTATC-3’，下游引物为5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；内参照U6上游引物为5’-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3’，下游引物5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。利用OpenArray MicroRNA Real-Time PCR Master Mix试剂盒说明书分别加入miRNA-181a引物或内参照U6引物、逆转录cDNA模板，置于ABI7300荧光实时定量PCR仪上进行扩增检测。miRNA-181a和内参照U6均设置3个复孔，每个样品进行3次重复检测，采用2-ΔΔCt方法对miRNA-181a相对表达量进行计算比较。

2.3 miRNA -181a过表达载体的构建、转染及检测 从miRNAs目标靶基因数据库中(http://www.mirbase.org)获得人miRNA-181a基因序列为5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’， 经由Invitrogen合成并构建带绿色荧光标记的pGenesil-miRNA-181a真核表达质粒。用培养基调整A549/DDP细胞浓度为5×108/L，每孔2 mL接种于6孔细胞培养板中，待细胞贴壁生长至50%以上后用于转染。将Lipofectamine 2000脂质体转染试剂和合成构建的miRNA-181a表达载体以2∶1体积比列混合后瞬时转染至各孔A549/DDP细胞中，同时设置未转染组和pGenesil空载组。转染培养24 h后在倒置荧光显微镜下观察转染效率，并继续培养以备后续实验。转染培养48 h后按照上述步骤方法提取各组细胞中的总RNA， miRNA181a逆转录引物反转后利用实时荧光定量PCR方法检测转染后各组A549/DDP细胞中miRNA-181a表达的变化。

2.4 MTT法检测细胞活力和抑制率 将miRNA-181a转染A549/DDP后12 h的细胞(5×107/L)每孔 200 μL接种于96孔板中，同时设置未转染组和空载组。先继续分别培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后，在每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 g/L)，在37 ℃培养箱中继续培养4 h后吸弃培养基，在每孔中加入150 μL的DMSO，振荡混匀10 min后，置于酶标仪上测定570 nm波长各孔的吸光度(A)值。每组细胞设置3个复孔。同时将miRNA-181a转染24 h的A549/DDP细胞接种于96孔板中，在细胞贴壁生长后各组细胞更换含不同浓度(0、5、10、15、20 μmol/L)顺铂的培养基连续培养48 h。培养结束后按照相同的方法测定各组细胞在570 nm处的A值，并计算各组细胞在顺铂作用下的生长抑制率，按照公式计算各组细胞生长抑制率(%)=(1-加药组A值)/未加药对照组A值×100%。

2.5 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡 收集miRNA-181a转染A549/DDP 24 h后的各组细胞经PBS重悬后制成单细胞悬液，先加入70%预冷的乙醇在4 ℃固定12 h后，离心弃上清并清洗去乙醇，用500 μL的PBS重悬细胞加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)和RNaseA(50 mg/L)室温避光孵育30 min后经流式细胞仪上样测定各组A549/DDP细胞周期并计算各周期百分比。同时收集miRNA-181a转染24 h后的各组细胞，根据2.4实验更换含10 μmol/L DDP的培养基继续培养24 h，分别在各组细胞中加入细胞凋亡检测试剂(5 μL FITC标记的Annexin V和10 μL PI)，37 ℃下避光孵育20 min后，PBS洗涤1次并重悬经流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

2.6 Transwell实验检测细胞的侵袭能力 收集miRNA-181a转染24 h后的A549/DDP细胞，并用培养基重悬稀释细胞浓度为1×108/L，然后每孔200 μL种植于预先用1 g/L的,Matrigel胶包被的Transwell板上室中，下室中为加入含20%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基600 μL，每组设置3个复孔，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养48 h。等培养结束后用4%的多聚甲醛固定小室的滤膜，并擦去上表面的细胞，用结晶紫染色液染色10 min后，PBS洗涤3次，在显微镜下观察各组A549/DDP细胞侵袭穿过滤膜的细胞，并随机拍照计数各组细胞的侵袭率。细胞侵袭率=(各组平均侵袭细胞数/未处理对照组侵袭细胞数)×100%。

2.7 Western blot法检测miRNA-181a靶基因蛋白的表达 miRNA-181a转染A549/DDP细胞24 h后，消化离心收集细胞，并用PBS洗涤1次，加入RAPI细胞裂解液裂解各组细胞并提取总蛋白，利用BCA试剂盒测定各组细胞中总蛋白浓度。各组取30 μg总蛋白进行10%的SDS-PAGE 2 h后，进行半干法转PVDF膜，封闭30 min后孵育多克隆兔抗人Bcl-2、P53、β-actin的I抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，用TBST洗涤 5 min 3次；然后室温孵育HRP标记的山羊抗兔IgG II抗(1∶5 000)2 h，再用TBST洗涤3次后用ECL化学发光显影，并曝光扫描拍照，用Quantity One软件分析各组A549/DDP细胞中miRNA-181a靶基因蛋白Bcl-2和P53的相对表达量。

3 统计学处理

所有数据采用统计学软件SPSS 17.0进行分析，并用均数±标准差(mean±SD)表示。符合正态分布两组间计量数据比较采用t检验，多组间计量数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析，用SNK-q进行均数之间的两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miRNA-181a在不同细胞系中的表达

miRNA-181a在BEAS-2B细胞中相对表达量为1.05±0.03，而A549细胞中miRNA-181a相对表达量显著下降为0.35±0.06，与BEAS-2B细胞相比差异有统计学显著性(P<0.05)；而A549/DDP细胞中miRNA-181a相对表达量也显著下降为0.13±0.05，与BEAS-2B、A549细胞系相比，差异均有统计学显著性(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of miRNA-181a in different cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsBEAS-2B group;#P<0.05vsA549 group.

图1 miRNA-181a在BEAS-2B、A549和A549/DDP细胞中的表达

2 miRNA-181a转染A549/DDP细胞后的表达情况

上述实验发现miRNA-181a在A549/DDP细胞中表达量最低，为进一步研究miRNA-181a对人非小细胞肺癌细胞功能的影响，将pGenesil-miRNA-181a真核表达质粒通过瞬时转染至A549/DDP细胞中。在倒置荧光显微镜下发现miRNA-181a空载组和转染组转染A549/DDP细胞48 h后发绿色荧光，说明miRNA-181a能够转染至A549/DDP细胞中，转染效率均达80%以上，而未转染组细胞中未见绿色荧光。同时利用实时荧光定量PCR检测发现miRNA-181a转染A549/DDP细胞后其表达量显著增加。与未转染组和空载转染组相比，miRNA-181a转染组中miRNA-181a表达量上升约(14.93±0.96)倍(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of miRNA-181a in transfected A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

图2 miRNA-181a转染A549/DDP后细胞的表达变化

3 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞活力的影响

MTT实验检测发现miRNA-181a转染组的A549/DDP细胞活力受到抑制，显著低于未转染组和空载组，并呈时间依赖性(P<0.05)。当DDP浓度为10 μmol/L时，miRNA-181a转染组的细胞生长抑制率已显著升高(P<0.05)，但未转染和空载组在DDP作用浓度上升为20 μmol/L时，其细胞生长抑制率才显著升高，说明miRNA-181a转染增强了A549/DDP细胞对DDP的敏感性，见图3、4。

4 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞周期的影响

流式细胞术检测发现miRNA-181a转染A549/DDP后能够抑制细胞周期中增殖期(S+G2/M期)比率。与未转染组A549/DDP细胞相比，miRNA-181a转染组中A549/DDP细胞中G0/G1期百分比显著升高(P<0.05)，而S+G2/M期百分比显著下降(P<0.05)。空载组中A549/DDP细胞G0/G1期和S+G2/M期百分比值与未转染对照组相比无明显变化，见图5。

5 miRNA-181a转染对A549/DDP在DDP作用下细胞凋亡的影响

利用流式细胞术检测在10 μmol/L的DDP作用下各组细胞的细胞凋亡情况，结果显示miRNA-181a转染组中A549/DDP细胞的凋亡率为(58.96±4.45)%，明显高于未转染组和空载组(P<0.05)，见图6。

6 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞侵袭能力的影响

Transwell检测各组A549/DDP细胞的侵袭能力发现miRNA-181a转染能够降低A549/DDP细胞的侵袭能力，结果见图7。与未转染组和空载组的细胞相比，miRNA-181a转染组A549/DDP细胞的侵袭能力显著降低(P<0.05)。

Figure 3.The effect of miRNA-181a transfection on the cell activity of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfec-ted group;#P<0.05vsnegative group.

图3 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞活力的影响

Figure 4.The effect of miRNA-181a transfection on A549/DDP cell growth inhibition rate under DDP treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

图4 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞在DDP作用下生长抑制率的影响

Figure 5.The effect of miRNA-181a transfection on the cell cycle of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

图5 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞周期的影响

Figure 6.The effect of miRNA-181a transfection on the cell apoptosis of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

图6 miRNA-181a转染对A549/DDP在DDP作用下细胞凋亡的影响

Figure 7.The effect of miRNA-181a transfection on the invasion ability of A549/DDP cells (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

图7 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞侵袭能力的影响

7 miRNA-181a转染对A549/DDP细胞中Bcl-2和P53蛋白表达的影响

Western blot法检测miRNA-181a转染A549/DDP细胞对miRNA-181a的靶基因bcl-2和p53蛋白表达的影响，结果见图8。与未转染组和空载组比较， miRNA-181a转染组A549/DDP细胞P53蛋白表达量显著升高，而Bcl-2蛋白表达量显著下降 (P<0.05)。

讨 论

miRNA作为一种进化上高度保守的小分子RNA，虽然不被翻译但能够显著调控其它基因表达，目前miRNA与肿瘤的相关性研究受到广泛关注，而部分miRNA可能成为肿瘤治疗新的靶点[7-8]。miRNA-181家族在肝癌、胃癌、乳腺癌、白血病等恶性肿瘤的发生和发展中均发挥抑癌或促癌的重要作用，并与多种恶性肿瘤的耐药性、临床诊断及预后密切相关[9]。miRNA-181a是miRNA-181家族中重要成员之一，在基因组中表现进化保守性，参与细胞的分化调控，它能够抑制多种细胞增殖并促进细胞凋亡，且在不同组织细胞中具有表达差异[10-11]。目前关于miRNA-181a在非小细胞肺癌中的表达情况及在非小细胞肺癌细胞中的功能研究尚少见。因此，本研究检测miRNA-181a在不同非小细胞肺癌细胞中的表达，并利用miRNA-181a真核表达质粒转染A549/DDP细胞，以揭示其在非小细胞肺癌细胞中发挥的作用。

Figure 8.The effect of miRNA-181a transfection on the protein expression of Bcl-2 and P53 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsuntransfected group;#P<0.05vsnegative group.

图8 miRNA-181a转染A549/DDP细胞对miRNA-181a靶基因蛋白Bcl-2和P53表达的影响

以往研究表明，miRNA-181a在不同肿瘤中表达具有差异性，其在乳腺癌、胃癌中表达量显著升高，而在口腔鳞状细胞癌中低表达[12-13]。本研究为揭示miRNA-181a在人非小细胞肺癌中表达差异，选用人正常肺上皮细胞BEAS-2B为对照，检测发现miRNA-181a在人肺腺癌细胞A549及耐药细胞A549/DDP中表达量显著低于BEAS-2B细胞，说明miRNA-181a在非小细胞肺癌细胞中低表达，推测其可能在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用。为进一步验证这一结论，选择表达量最低的A549/DDP为研究对象并通过转染miRNA-181a，使其在A549/DDP中高表达。本研究发现miRNA-181a转染后能够抑制A549/DDP细胞活性，并显著提高A549/DDP的增殖抑制率，直接说明miRNA-181a在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用，与冯春来等[14]关于miRNA-181a影响A549/DDP细胞顺铂耐药性的研究具有一致性。

细胞生长受到细胞周期的调控，细胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和细胞分裂暂停期(G0期)，其中S期长短可以反映细胞增殖能力强弱[15]。相关研究[16]表明miRNA均能发挥调控细胞周期的作用。本研究中miRNA-181a转染A549/DDP细胞后，其G0/G1期显著增加，但反映细胞增殖状态的S+G2/M期显著下降，说明上述miRNA-181a 抑制A549/DDP细胞活力是其通过阻滞细胞周期而发挥作用的。而在低浓度(10 μmol/L) DDP作用下，未转染组和空载组A549/DDP细胞凋亡率较低，但miRNA-181a转染后其凋亡率显著上升，说明miRNA-181a提高顺铂作用下A549/DDP细胞的生长抑制率可能是通过促进细胞凋亡发挥作用的。

肺癌细胞侵袭是其肿瘤恶性的生物标志，A549/DDP作为具有多药耐药性的非小细胞肺癌细胞系，具有较强的侵袭能力[17]。但本研究中，miRNA-181a转染A549/DDP细胞后，检测发现其侵袭能力显著下降，侵袭率为未转染组和空载组的1/3,说明miRNA-181a能够抑制A549/DDP的侵袭能力。已有研究利用双萤光素酶报告基因实验验证bcl-2和p53是miRNA-181a发挥促凋亡作用的下游靶基因，并能够被miRNA-181a调控表达[18]。为进一步研究miRNA-181a对A549/DDP细胞功能发挥作用的机制，利用Western blot法检测miRNA-181a转染对A549/DDP细胞中Bcl-2和P53表达的影响。Bcl-2蛋白是bcl-2原癌基因编码的产物，发挥促进癌细胞存活的作用，并能够抑制细胞凋亡[19]。而抑癌基因p53是一种抑制细胞癌变的基因，并是与人类肿瘤相关性最高的基因，其产物P53蛋白发挥抑癌作用[20]。本研究中发现miRNA-181a转染A549/DDP后，细胞中Bcl-2表达显著下降而P53蛋白表达上升，说明miRNA-181a能够通过抑制A549/DDP细胞Bcl-2表达且促进P53表达而发挥抑癌作用。

综上所述，本研究证实miRNA-181a在人肺腺癌A549及耐药A549/DDP细胞中低表达且以A549/DDP为甚，而高表达miRNA-181a可抑制A549/DDP的细胞活力、细胞周期、侵袭能力，提高顺铂作用下的生长抑制率和凋亡率，作用机制可能与抑制Bcl-2蛋白且促进P53蛋白表达有关。本研究表明miRNA-181a在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用，其可能会成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。

[1] Huntzinger E, Izaurralde E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay[J]. Nature Rev Genetics, 2011, 12(2): 99-110.

[2] Mendell JT, Olson EN. MicroRNAs in stress signaling and human disease[J]. Cell, 2012, 148(6):1172-1187.

[3] 焦良波，陈 涛，胡 卫. 肝癌干细胞中microRNAs的功能研究进展[J]. 广东医学, 2014, 35(18):2939-2942.

[4] Debernardi S, Skoulakis S, Molloy G, et al. MicroRNA miR-181a correlates with morphological sub-class of acute myeloid leukaemia and the expression of its target genes in global genome-wide analysis[J]. Leukemia, 2007, 21(5): 912-916.

[5] Chen G, Zhu W, Shi D, et al. MicroRNA-181a sensitizes human malignant glioma U87MG cells to radiation by targeting Bcl-2[J]. Oncol Reports, 2010, 23(4):997-1003.

[6] 徐 磊，蒋 峰，杨 欣，等. 非小细胞肺癌组织微小 RNA-145 表达及其与预后的关系[J]. 中华实验外科杂志, 2014, 31(1):177-179.

[7] 韦尉元，曹稳珑，张笑石，等. MicroRNA-1284 在胃癌中的表达及其作用机制研究[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(3):440-446.

[8] She X, Yu Z, Cui Y, et al. miR-181 subunits enhance the chemosensitivity of temozolomide by Rap1B-mediated cytoskeleton remodeling in glioblastoma cells[J]. Med Oncol, 2014, 31(4):1-10.

[9] Pichler M, Winter E, Ress AL, et al. miR-181a is associated with poor clinical outcome in patients with colorectal cancer treated with EGFR inhibitor[J]. J Clin Pathol, 2014, 67(3):198-203.

[10]Zou C, Chen J, Chen K, et al. Functional analysis of miR-181a and Fas involved in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma pathogenesis[J]. Exp Cell Res, 2015, 331(2):352-361.

[11]Wei Z, Cui L, Mei Z, et al. miR-181a mediates metabolic shift in colon cancer cells via the PTEN/AKT pathway[J]. FEBS Lett, 2014, 588(9):1773-1779.

[12]Brockhausen J, Tay SS, Grzelak CA, et al. miR-181a mediates TGF-β induced hepatocyte EMT and is dysregulated in cirrhosis and hepatocellular cancer[J]. Liver Int, 2015, 35(1):240-253.

[13]Liu J, Xu D, Wang Q, et al. LPS induced miR-181a promotes pancreatic cancer cell migration via targeting PTEN and MAP2K4[J]. Dig Dis Sci, 2014, 59(7):1452-1460.

[14]冯春来，王智刚，李 皓. MicroRNA-181a 提高 A549/DDP 细胞顺铂敏感性的研究[J]. 实用肿瘤杂志, 2012, 27(6):583-586.

[15]乐涵波，竺王玉，刘晓光，等. microRNA-429 对人肺腺癌细胞 SPC-A1 增殖抑制的影响[J]. 中华胸心血管外科杂志, 2014, 30(12):733-735.

[16]韩继明，霍满鹏，慕明涛，等. miR-497 靶向细胞周期蛋白 E1 抑制宫颈癌 HeLa 细胞的增殖[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2014, 30(6):597-600.

[17]Yao CC, Tu YR, Jiang J, et al. β-elemene reverses the drug resistance of lung cancer A549/DDP cells via the mitochondrial apoptosis pathway[J]. Oncol Reports, 2014, 31(5):2131-2138.

[18]Cheah YK, Cheng RW, Yeap SK, et al. Analysis ofTP53 gene expression and p53 level of human hypopharyngeal FaDu (HTB-43) head and neck cancer cell line after microRNA-181a inhibition[J]. Genetics Mol Res, 2014, 13(1): 1679-1683.

[19]Garg M. Targeting microRNAs in epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem cells: therapeutic approaches in cancer[J]. Expert Opinion Ther Targets, 2015, 19(2):285-297.

[20]Xin J, Zhang XK, Xin DY, et al. FUS1 acts as a tumor-suppressor gene by upregulating miR-197 in human glioblastoma[J]. Oncol Reports, 2015, 34(2): 868-876.

(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Expression of miRNA-181a in human lung adenocarcinoma cells and its effect on cell function

ZHAO Duo, JIN Zhu, SONG Ya-ya, GAO Bao-an

(InstituteofRespiratoryDisease,ChinaThreeGorgesUniversity,DepartmentofRespiration,YichangCentralPeople’sHospital,Yichang443003,China.E-mail: 222xiaozhao@163.com)

AIM: To study the expression of microRNA (miRNA)-181a in different human lung adenocarcinoma cell lines, and to investigate the effect of miRNA-181a on cell function and its mechanism in human lung adenocarcinoma drug resistant cell A549/DDP. METHODS: Real-time PCR was used to detect the expression of miRNA-181a in BEAS-2B cells, A549 cells and A549/DDP cells. The A549/DDP cells were transfected with pGenesil-miRNA-181a eukaryotic expression plasmid. At the same time, the untransfection group and negative transfection group were also set up. The expression of miRNA-181a, cell viability, cell growth inhibition and apoptosis rate duringcis-diamminedichloroplatinum (DDP) treatment, cell cycle, cell invasion, the protein expression of miRNA-181a target genesbcl-2andp53 in the A549/DDP cells were determined by real-time fluorescence quantitative PCR, MTT assay, flow cytometry, Transwell method and Western blot, respectivly. RESULTS: The expression of miRNA-181a in A549 cells and A549/DDP cells was significantly lower than that in BEAS-2B cells, and the lowest expression level was observed in A549/DDP cells (P<0.05). The expression of miRNA-181a in A549/DDP cells was significantly increased after transfection with pGenesil-miRNA-181a (P<0.05). The cell viability, cell cycle and invasion ability of the A549/DDP cells were inhibited after miRNA-181a transfection (P<0.05). The cell growth inhibition rate and apoptotic rate of the A549/DDP cells were increased (P<0.05). The expression of Bcl-2 was reduced, but the expression of P53 was increased after transfection with miRNA-181a in A549/DDP cells (P<0.05). CONCLUSION: miRNA-181a may be correlated with the development of human lung adenocarcinoma. miRNA-181a can serve as a new target for treatment of lung cancer.

MicroRNA-181a; A549/DDP cell line; Cell cycle; Apoptosis; Cell invasion

1000- 4718(2016)08- 1395- 08

2015- 12- 24

2016- 05- 25

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.009

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△通讯作者 Tel: 0717-6526428； E-mail：222xiaozhao@163.com