胰岛素联合硒协同抗糖尿病心肌细胞凋亡的作用*

徐天娇， 刘 勇， 李 萍， 胥晓丽， 曾菊绒

(1西安医学院药理学教研室，陕西 西安 710021； 2延安大学咸阳医院老年病科，陕西 咸阳 712000)

胰岛素联合硒协同抗糖尿病心肌细胞凋亡的作用*

徐天娇1△， 刘 勇2△， 李 萍1， 胥晓丽1， 曾菊绒1

(1西安医学院药理学教研室，陕西 西安 710021；2延安大学咸阳医院老年病科，陕西 咸阳 712000)

目的： 观察胰岛素联合硒对糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)大鼠心肌细胞凋亡、Ku70、乙酰化Ku70、Bax和细胞色素C(cytochrome C)蛋白水平的影响，初步探讨胰岛素和硒协同抗DCM的机制。方法: 将SD大鼠50只随机分为空白对照组(control组)、糖尿病心肌病模型组(DCM组)、糖尿病心肌病+胰岛素(DCM+In)组、糖尿病心肌病+硒(DCM+Se)组和糖尿病心肌病+胰岛素+硒(DCM+In+Se)组。流式细胞术检测心肌细胞线粒体膜电位；末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling，TUNEL)法观察心肌细胞凋亡；Western blot 法观察Ku70、Bax和cytochrome C蛋白水平的变化；免疫共沉淀法检测Ku70乙酰化。 结果: 与对照组比较，DCM组大鼠心肌细胞发生明显凋亡(P<0.01)，Ku70和乙酰化Ku70表达明显增加(P<0.01)，Bax由胞浆向线粒体转位同时cytochrome C由线粒体向胞浆转位(P<0.01)；与DCM+In组或DCM+Se组比较，胰岛素联合硒明显抑制心肌细胞凋亡(P<0.05)，下调Ku70以及乙酰化Ku70的表达(P<0.05)并阻止Bax和cytochrome C转位(P<0.05)。结论: 胰岛素和硒可能通过调控Ku70乙酰化和抑制Bax转位而协同抗糖尿病心肌细胞凋亡。

胰岛素； 硒； 糖尿病心肌病； Ku70； 乙酰化

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病诸多慢性并发症中危害性最大，最常见的心血管并发症，已成为糖尿病患者心衰及猝死的重要原因。DCM现已被公认是一个独立的、特异的心肌疾病，其早期临床特征是左心室舒张功能障碍，晚期以收缩功能障碍为主，可诱发心力衰竭、心源性休克和猝死。

高血糖及其诱导的氧化应激在DCM的发生、发展中具有重要作用，其可促使心肌细胞凋亡[1-3]。研究表明，氧化应激刺激可显著升高Ku70及乙酰化Ku70表达，并促使Bax的转位而诱导细胞凋亡，当心肌细胞凋亡达到一定数量就会导致心室重构和心力衰竭[4-6]。

我们前期研究已经证明，胰岛素和硒联合应用在降低血糖、糖化血红蛋白以及血脂方面具有协同作用[7]；胰岛素和硒联合能够显著改善DCM大鼠心肌胶原网络重构并减少心肌胶原纤维堆积；显著升高左室收缩末压、左室舒张末压、左室内压最大下降速率，同时降低左室内压最大上升速率[8]。但目前尚不清楚胰岛素与硒联合协同抗DCM的机制，故此，本研究通过观察药物对心肌细胞凋亡、K70/乙酰化Ku70的蛋白水平、Bax和细胞色素C(cytochrome C)转位的影响，初步探讨胰岛素联合硒协同抗DCM的机制，以期为DCM的研究提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 实验动物和试剂

选取体重180～230 g的SD大鼠，雌雄各半，分笼饲养，房间温度保持在25 ℃左右，湿度在50%左右，适应性喂养 1 周。

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和亚硒酸钠购于Sigma；中效胰岛素由丹麦诺和灵公司生产；anti-Ku70、anti-Bax、anti-cytochrome C、protein A/G beads、anti-β-actin等均购自Santa Cruz；anti-COX4购于Gene Tex。

2 方法

2.1 动物模型制备及分组 用STZ(55 mg/kg)一次性腹腔注射，1周后取尾静脉血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++～++++者原饲料继续喂养6周后(即第8周后)心脏超声诊断仪评价大鼠心功能。M型超声模式下测定左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)和左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)，仪器自动计算左室射血分数(ejection fraction，EF)和左室短轴缩短率(fractional shortening，FS)以评价心脏收缩功能；组织多普勒模式下测定舒张早期二尖瓣环峰值运动速度(early diastolic mitral annular velocity，Em)和舒张晚期二尖瓣环峰值运动速度(end diastolic mitral annular velocity，Am)并计算Em/Am以评价心脏舒张功能。凡EF、FS和Em/Am明显下降(Em/Am<1)，且血糖仍稳定在16.7 mmol/L以上者纳入糖尿病心肌病大鼠模型。

将大鼠随机分为5组，每组10只：空白对照(control)组：自由进水和饮食； 糖尿病心肌病模型(DCM)组：自由进水和饮食； 糖尿病心肌病+胰岛素(DCM+In)组：按1 U·kg-1·d-1皮下注射胰岛素；糖尿病心肌病+硒(DCM+Se)组：按180 μg·kg-1·d-1管饲亚硒酸钠；糖尿病心肌病+胰岛素+硒(DCM+In+Se)组：按1 U·kg-1·d-1皮下注射胰岛素同时管饲180 μg·kg-1·d-1亚硒酸钠。每组均连续给药6周。

2.2 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测线粒体膜电位 取适量心肌组织制成单细胞悬液，将100 μL细胞悬液加入5 mL的流式测定管中，在测定管中加入1 μL JC-1工作液，阴性对照管不加，轻轻混匀。将测定管和对照管置于37 ℃培养箱中孵育15～20 min；吸取500 μL PBS缓冲液分别加入测定管中，上机检测。流式细胞仪激发波为488 nm，红色荧光的最大发射波长为580/590 nm，绿色荧光的最大发射波长为510/527 nm，以红/绿荧光强度比值代表细胞线粒体膜电位。

2.3 末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling， TUNEL)检测细胞凋亡 心肌组织经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。切片在二甲苯中脱蜡 5～10 min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10 min。无水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸馏水2 min。滴加适量不含DNase的蛋白酶K，37 ℃作用20 min，PBS 洗涤3次。滴加 TUNEL 反应混合液于湿盒中，37 ℃反应 1 h，PBS洗3 min 3次；擦去切片多余的液体，加适量DAB 溶液至切片上，室温下放置 5 min： 除去 DAB 液体，蒸馏水洗3次。苏木素复染，1%盐酸乙醇分化，蒸馏水反蓝 10 min。逐级脱水，透明，中性树脂封片。在光镜下观察，以细胞核呈棕黄色为凋亡阳性细胞。在显微镜下(×400)计数凋亡细胞和总细胞数，并计数凋亡指数(apoptosis index，AI)=凋亡细胞/总细胞数×100%。

2.4 Western blot 法检测Ku70、胞浆/线粒体Bax和胞浆/线粒体cytochrome C的蛋白水平 使用组织线粒体分离试剂盒提取细胞浆蛋白和线粒体蛋白，严格按照步骤操作把新鲜的心肌组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片；加入预冷的PBS，冰浴3 min。600×g离心10～20 s，沉淀组织样品，弃上清。再加入预冷的胰酶消化液，冰浴20 min。600×g离心10～20 s，沉淀组织样品，弃上清。加入相应线粒体分离试剂，重悬组织，用于洗去残余的胰酶。600×g离心10～20 s，沉淀组织样品，弃上清。加入预冷的添加了PMSF的线粒体分离试剂，在冰浴上进行匀浆，匀浆20～30次。600×g、4 ℃离心5 min。小心把上清转移到另一离心管中，在11 000×g、4 ℃离心10 min。小心把上清转移到另一离心管中。所得沉淀即为分离得到的线粒体。随后把收集的上清12 000×g、4 ℃离心10 min。取上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。

取各组样品50 μg蛋白质，进行SDS-PAGE分离蛋白，并将蛋白电转移至PVDF膜上，再用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h；加适当比例稀释的第 I 抗体，4 ℃过夜；洗膜后加辣根过氧化物酶标记的II抗，室温轻摇1 h，充分洗涤后与ECL反应，即刻与X光片曝光，目的条带使用分析仪进行分析。

2.5 免疫共沉淀(co-immunoprecition, Co-IP)检测心肌细胞中乙酰化Ku70的蛋白水平 取经提取的总蛋白300 μg加入1.5 mL预先放置了裂解液的离心管，加入5 μg的IP抗体， 4 ℃孵育2 h；加入30 μL protein A/G beads，4 ℃翻转1 h；4 ℃下离心5 min，弃去上清液；Protein A/G beads用裂解液(1 mL)洗3～4次，离心同上；加入15 μL 2×电泳上样缓冲液，煮3～5 min。离心，取上清液；将上清液50 μg 进行SDS-PAGE分离蛋白。并将蛋白电转移至PVDF膜上。再用含5%脱脂奶粉的TBS封闭1 h；加入适当稀释的 I 抗后于4 ℃条件下孵育过夜；洗膜后加辣根过氧化物酶标记的 II 抗，室温轻摇1 h，充分洗涤后与ECL反应，即刻与X光片曝光。

3 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较应用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较应用Tukey HSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 胰岛素和硒协同抑制DCM大鼠心肌细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，与control组比较，DCM组线粒体膜电位显著性降低(P<0.01)；与DCM组比较，DCM+In组、DCM+Se组和DCM+In+Se组线粒体膜电位明显增加(P<0.01)；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组线粒体膜电位明显增加(P<0.01),见图1。

TUNEL法检测凋亡心肌细胞核呈棕黄色染色，control组大鼠心肌细胞核极少有棕黄染色(AI约为5%)；DCM组大鼠心肌细胞中出现大量棕黄染色(AI为 30%～40%)，与control组比较差异存在统计学显著性(P<0.01)； DCM+In组(AI约为24%左右)和DCM+In+Se组(AI约为15%左右)心肌细胞棕黄色颗粒均明显减少，与DCM组比较差异有统计学显著性(P<0.05)，而DCM+Se组(AI约为28%左右)与DCM组相比差异没有统计学显著性；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组心肌细胞中棕黄色染色显著性减少(P<0.05),见图 2。以上结果说明胰岛素和硒能够协同抑制DCM大鼠心肌细胞凋亡。

2 胰岛素和硒能够显著抑制Ku70的表达

Western blot实验结果显示，与control组比较，DCM组Ku70表达显著增加(P<0.01)；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组Ku70表达明显减少(P<0.05)；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组Ku70水平显著降低(P<0.05),见图 3。这些结果说明，胰岛素和硒能够协同降低DCM大鼠心肌组织中Ku70的表达。

3 胰岛素和硒能够显著抑制DCM大鼠心肌细胞Ku70乙酰化

IP-Western blot 实验结果显示，与control组比较，DCM组乙酰化Ku70显著增加；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组乙酰化Ku70明显减少；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组乙酰化Ku70水平显著减少(图4)。这些结果说明，胰岛素和硒能够协同抑制DCM大鼠心肌组织中Ku70乙酰化。

Figure 1.The changes of mitochondria membrane potential (MMP) in different groups. Mean±SD.n=3 .**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsDCM;▲▲P<0.01vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

图1 各实验组心肌细胞线粒体膜电位变化

Figure 2.The cell apoptosis in different groups. Mean±SD.n= 3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsDCM;▲P<0.05vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

图2 各实验组心肌细胞凋亡的变化

Figure 3.Ku70 levels in different groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsDCM;▲P<0.05vsDCM+In;#P<0.05vsDCM+Se.

图3 各实验组心肌细胞中Ku70的表达

Figure 4.The protein levels of acetylated Ku70 in different groups. The protein lysates were immunoprecipitated with anti-acetylated lysine antibody. The resulting protein complexes were then immunoblotted for determining Ku70. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsDCM;▲▲P<0.01vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

图4 各实验组心肌细胞中乙酰化Ku70蛋白的水平

4 胰岛素和硒显著抑制Bax和cytochrome C的转位

Western blot实验结果显示，与control组比较，DCM组胞浆中Bax明显减少而线粒体中明显增加(P<0.01)，cytochrome C则是胞浆中明显增加而线粒体中明显减少(P<0.01)；与DCM组比较，DCM+In组和DCM+In+Se组Bax胞浆中明显增加而线粒体中明显减少(P<0.01)，cytochrome C在胞浆中明显减少而在线粒体中明显增加(P<0.01)，DCM+Se组仅线粒体中cytochrome C表达量明显增加(P<0.05)；与DCM+In组和DCM+Se组比较，DCM+In+Se组的Bax在胞浆中明显增加而在线粒体中明显减少(P<0.05)，cytochrome C在胞浆中明显减少而在线粒体中明显增加(P<0.05),见图 5。这些说明，糖尿病心肌病时心肌组织中Bax和cytochrome C发生明显转位，而胰岛素联合硒则能协同抑制Bax和cytochrome C的转位。

讨 论

糖尿病是一种威胁全人类健康的疾病。国际糖尿病联合会报道，预计到2025年全世界糖尿病患者将达到3.33亿。我国截止2010年糖尿病患者已有9240万，而糖尿病前期的患者则高达1.48亿，防控形势十分严峻[9]。随着糖尿病发病率增高及病程的延长， DCM已成为糖尿病患者死亡的主要原因之一。DCM 的发病机制错综复杂，涉及多方面因素。

高血糖是 DCM 的关键始动因素，在 DCM 的发病机制中起着核心作用。长期高血糖能直接引起正常心肌细胞结构和功能异常，导致糖尿病性心肌病变，促使心肌细胞凋亡增加。另外，高血糖还可以显著增加氧化应激水平[10-11]，而氧化应激又可引起基因表达异常，改变信号传导，引起心肌细胞凋亡并最终影响心功能[1-2, 4, 12-14]。因此，如何早期使用药物在降低血糖的同时改善氧化应激水平对于改善心脏重构及舒缩功能异常，防止心肌肥大及心功能不全的发生显得尤为重要。

目前在DCM治疗上尚没有具体的特效治疗方案，主要是进行降糖和相应的对症治疗。胰岛素是控制高血糖的有效方法之一，在糖尿病及其并发症治疗中起着不可替代的作用，但仅对糖尿病急性并发症有效，而对糖尿病慢性并发症疗效欠佳。硒作为哺乳动物和人类必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的主要活性成分，具有显著的抗氧化性，另一方面其还具有类胰岛素样作用。故此，我们提出将胰岛素与硒联合用于DCM。结果显示，DCM大鼠心肌细胞线粒体膜电位显著性下降并且细胞发生明显凋亡；胰岛素和硒联合应用后能够显著升高DCM大鼠心肌细胞线粒体膜电位，抑制心肌细胞凋亡，这说明两药联合在抑制心肌细胞凋亡方面明显优于胰岛素或硒治疗。

Figure 5.The protein levels of Bax and cytochrome C in different groups. A: Bax level in the cytoplasm; B: Bax level in the mitochondria; C: cytochrome C level in the cytoplasm; D: cytochrome C level in the mitochondria. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsDCM;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsDCM+In;##P<0.01vsDCM+Se.

图5 各组心肌组织Bax和cytochrome C蛋白水平的变化

Ku70是一种在细胞浆和细胞核中均有分布的蛋白，胞浆中的Ku70蛋白与前凋亡蛋白Bax结合，抑制Bax由细胞浆向线粒体转位而发挥抗凋亡作用[15]。当Ku70被乙酰化后可释放出结合的Bax，促进Bax从胞浆进入线粒体而cytochrome C则由线粒体进入胞浆，从而启动细胞的线粒体凋亡途径。因此，抑制Ku70乙酰化是抑制细胞凋亡的重要手段之一。鉴于此，本实验进一步研究胰岛素与硒对Ku70、乙酰化Ku70表达以及Bax和cytochrome C转位的影响。实验发现DCM组Ku70/乙酰化Ku70表达显著性增加，并且Bax由细胞浆向线粒体转位而cytochrome C则由线粒体向细胞浆转位，这说明DCM时心肌细胞胞浆中的Ku70被乙酰化后促使了Bax由胞浆向线粒体的转位，从而诱导心肌细胞凋亡并最终会影响心功能；DCM大鼠经胰岛素治疗后只能部分降低Ku70、乙酰化Ku70的蛋白水平和阻止Bax及cytochrome C的转位，而胰岛素和硒联合治疗后则显著性降低Ku70/乙酰化Ku70水平并能够显著逆转Bax及cytochrome C转位，这说明联合用药在纠正Ku70/乙酰化Ku70水平、逆转Bax及cytochrome C转位方面明显优于单独用药组。

基于以上研究，我们认为胰岛素联合硒可能通过影响Ku70乙酰化和阻止Bax转位来抑制心肌细胞凋亡，发挥协同抗DCM效应。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Synergistic effect of insulin and selenium in combination on inhibiting myocardial apoptosis in rats with diabetic cardiomyopathy

XU Tian-jiao1, LIU Yong2, LI Ping1, XU Xiao-li1, ZENG Ju-rong1

(1DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China;2DepartmentofGeriatrics,XianyangHospitalofYanAnUniversity,Xianyang712000,China.E-mail:xtj1118@163.com; 15991883311@163.com)

AIM: To investigate the effect of insulin and selenium in combination on the apoptosis and the expression of Ku70, acetylated Ku70, Bax and cytochrome C in myocardial cells of the rats with diabetic cardiomyopathy(DCM), and to explore the mechanism of insulin and selenium in their synergistic anti-DCM effect. METHODS: SD rats (n=50) were randomly grouped into control, DCM, DCM with insulin treatment (DCM+In) group, DCM with selenium treatment (DCM+Se) group, and DCM with insulin and selenium combination treatment (DCM+In+Se) group. Mitochondrial membrane potential (MMP) was measured by flow cytometry. The cell apoptosis was observed by terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL). The levels of Ku70, Bax and cytochrome C were examined by Western blot. The acetylation status of Ku70 was detected by co-immunoprecipitation.RESULTS: The rats in DCM group showed marked cell apoptosis compared with the control rats. The levels of Ku70 and acetylated Ku70 declined significantly compared with control group. Bax significantly translocated from cytoplasm into mitochondria and cytochrome C translocated from mitochondria into cytoplasm compared with control group. Compared with DCM+In group or DCM+Se group, insulin and selenium in combination significantly inhibited the apoptosis, down-regulated Ku70 and acetylated Ku70 levels, and prevented Bax and cytochrome C translocation.CONCLUSION: Insulin and selenium synergistically inhibits myocardial apoptosis by regulating Ku70 acetylation and inhibiting Bax translocation.

Insulin; Selenium; Diabetic cardiomyopathy; Ku70; Acetylation

1000- 4718(2016)08- 1357- 07

2016- 01- 07

2016- 06- 13

陕西省教育厅自然科学项目(No. 15JK1633)；西安医学院重点学科建设经费资助(2016年～2019年)

R587.1; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.003

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 徐天娇 Tel： 029-86177562; E-mail: xtj1118@163.com; 刘勇 Tel: 029-33783376; E-mail: 15991883311@163.com