MEF2C介导microRNA-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用*

唐春梅， 朱杰宁， 朱文思1, ， 林秋雄， 胡志琴， 符永恒， 张梦珍， 邓春玉，谭虹虹， 吴书林， 单志新△

(1南方医科大学，广东 广州510515； 2广东省心血管病研究所，广东省人民医院，广东省医学科学院， 广东 广州 510080)

·论 著·

MEF2C介导microRNA-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用*

唐春梅1,2， 朱杰宁2， 朱文思1, 2， 林秋雄2， 胡志琴1,2， 符永恒2， 张梦珍2， 邓春玉2，谭虹虹2， 吴书林2， 单志新2△

(1南方医科大学，广东 广州510515；2广东省心血管病研究所，广东省人民医院，广东省医学科学院， 广东 广州 510080)

目的： 研究微小RNA-214(miR-214)对心肌细胞肥大的调控作用及其可能的作用靶基因。方法: 建立血管紧张素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)诱导的C57BL/6乳小鼠心室肌细胞肥大模型；双萤光素酶报告基因实验检测miR-214与潜在靶基因MEF2C3’端非翻译区(3’UTR)的结合作用；实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 和Western blot 法分别检测MEF2C及肥厚标志物的mRNA和蛋白表达水平。结果: 心肌肥厚标志物ANP、ACTA1和β-MHC，以及miR-214的表达在Ang-II诱导肥大的小鼠心肌细胞中显著增强；双萤光素酶报告基因实验提示miR-214与MEF2C3’UTR相互作用，证实miR-214可在转录水平抑制MEF2C的表达，MEF2C蛋白水平在肥大的心肌细胞中显著上调；过表达miR-214及沉默MEF2C均能一致性地抑制Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞中肥大标志物的表达。 结论:MEF2C是miR-214的靶基因，并介导了miR-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用。

心肌肥厚； 微小RNA-214； MEF2C； 心肌细胞

心肌肥厚是心肌重构的重要组成部分，是心血管疾病最为常见的并发症之一。心肌肥厚是心肌对包括机械刺激、激素、细胞因子、生长因子或压力负荷增加等刺激作用下的代偿性适应。心肌肥厚时心肌标志蛋白表达水平升高，发生心肌细胞肥大，同时伴随有心肌细胞外间质增多、心脏重量增加，还伴有心肌成纤维细胞的增殖与转化以及心肌间质纤维化等病理改变，病理性心肌肥厚最终将导致心肌病和心衰[1]。尽管人们开展心肌肥厚的相关研究已有几十年，但对于心肌肥大发生和维持的确切机制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA)广泛存在于动植物中，是一类内源性的18～25个碱基的非编码单链RNA，通过碱基互补配对，与靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’-UTR)序列相互识别，抑制相应 mRNAs的翻译或降解特异mRNAs,其主要在转录后水平调控基因的表达[2-3]。越来越多的研究表明，心肌肥厚时miRNAs表达谱发生显著改变，一些miRNAs参与了心肌肥厚的病理过程，并发挥着重要作用[4-7]。已有研究显示[8-11]，miR-1、miR-208a、miR-195和miR-199a-5p在心肌肥厚时均上调表达，过表达miR-208a或miR-195的转基因小鼠，给予其促肥厚处理后，其心脏病理情况更为明显,给予心肌细胞过表达miR-1或过表达miR-199a-5p处理后，心肌细胞也发生明显的肥大。与之相反，心肌肥厚时，miR-150和miR-181b表达显著下调，且对心肌细胞给予过表达miR-150或 miR-181b处理之后，心肌细胞表面积会明显减小[10]。心肌肥厚时，miR-214的表达也发生显著改变[12]，提示miR-214可能参与了心肌肥厚的过程。然而，miR-214在心肌肥厚中的的作用机制目前仍不明确，本研究旨在探讨miR-214调控心肌细胞肥大的分子机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

限制性内切酶XhoI、EcoR I、转染试剂Lipofectamine 2000、TRIzol、逆转录试剂盒和4×SDS loa-ding buffer(Invitrogen)；2×SYBR Green Mix和RNase free water(TaKaRa)；miR-214 mimic和MEF2CsiRNA(广州锐博)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(碧云天)；GAPDH Ⅰ抗、 ACTA1 Ⅰ抗和Ⅱ抗(Protein Technology)；抗ANP抗体(Abcam)；抗β-MHC 抗体(Sigma)；蛋白Marker(Fermentas)； PVDF膜(Whatman)； ECL发光液(Bioword)；DMEM/F12细胞培养基(HyClone)；特级澳洲胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶粉末(广州威佳科技有限公司)。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

2 主要方法

2.1 乳小鼠心肌细胞原代分离培养及处理 取出生1～3 d SPF级C57BL/6乳小鼠心脏，以0.25%胰蛋白酶消化法原代分离细胞。乳小鼠心室肌细胞(neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs)与成纤维细胞由于贴壁速度不同而得以分离，收集上清中心肌细胞，将其接种于提前用1 %明胶包被过的12孔板中，用含有10 %胎牛血清及1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。培养24 h后，更换1次完全培养基至稳定培养48 h。采用10-8mol/L血管紧张素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)诱导小鼠心肌细胞发生肥大。分别将50 nmol/L scramble对照、miR-214 mimic和MEF2CsiRNA转染小鼠心肌细胞，24 h后结束实验。

2.2 FITC-鬼笔环肽(FITC-phallodin)染色 将NMVCs铺在预先放置了无菌圆形玻片的12孔板中。稳定生长后吸掉培养基，用PBS漂洗2次，加入500 μL的4%的多聚甲醛溶液固定，再用2 g/L的甘氨酸溶液中和多聚甲醛，摇床孵育2次，每次5 min。将10 mg/L的FITC标记的鬼笔环肽染料37 ℃孵育40 min，用1×PBS漂洗2次，再行Hoechst 33342反应液，避光37 ℃孵育40 min。将细胞爬片倒扣置另一个滴有30 μL防荧光淬灭封片剂的载玻片上，在倒置荧光显微镜下观察F-actin被染色后显示出细胞轮廓。

2.3 实时荧光定量PCR检测肥厚相关基因、MEF2C以及miR-214表达 用TRIzol试剂提取心肌细胞总RNA。取2.0 μg总RNA，加入5×的逆转录试剂4 μL(逆转录试剂盒)，用oligo (dT)15和random primers逆转录出cDNA用于检测编码基因mRNA水平。取1.0 μg总RNA，用miR-214特异的RT引物逆转录出cDNA用于检测miR-214水平。分别用GAPDH和U6作为检测编码基因和miR-214表达水平的内参照。在ViiATM7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)进行PCR反应和结果分析。以2-ΔΔCt法计算目标基因和miR-214的相对表达水平。本文所用PCR引物序列见表1。

2.4 Western blot 法检测蛋白水平 收集处理后的心肌细胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清进行蛋白定量后分装，加入4×上样缓冲液，100 ℃加热10 min使蛋白变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别用相应的抗体anti-ANP (1∶5 000)和anti-β-MHC(1∶1 000)、anti-ACTA1(1∶5 000)、anti-MEF2C(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加II抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h。ECL发光试剂盒显影，以GAPDH(1∶5 000)为内参照，扫描灰度值并分析蛋白表达相对含量。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse.

2.5 双萤光素酶报告实验验证miR-214与MEF2C3’UTR的结合作用 参照我们已报道方法[13]分别构建包含miR-214潜在结合序列的MEF2C3’UTR重组萤光素酶报告质粒pGL3-MEF2C-bs及包含结合序列突变的重组质粒pGL3-MEF2C-bs-MUT。利用HEK293细胞，将HEK293细胞(细胞密度约为每孔1×105)转染200 ng重组萤光素酶报告质粒，50 nmol/L miR-214 mimic以及10 ng pRL-TK(表达海肾萤光素酶的内参照质粒)。转染后24 h，测定萤火虫萤光素酶(firefly luciferase, FL)及海肾萤光素酶(Renillaluciferase, RL)强度，两种荧光强度比值(FL/RL)变化可反映miR-214与MEF2C3’UTR结合的能力。

3 统计学处理

用SPSS 21.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)并用SNK-q检验进行各组间的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-214 在肥大的心肌细胞中表达增强

FITC-phallodin染色结果显示10-8mol/L Ang-Ⅱ处理48 h后的NMVCs 发生显著的心肌细胞肥大。与空白组相比，Ang-Ⅱ处理的NMVCs中肥厚标志物ANP、ACTA1及β-MHC的mRNA表达和蛋白表达显著增强。上述结果表明Ang-Ⅱ能够成功诱导NMVCs出现肥大表型。同时， RT-qPCR结果显示miR-214在发生肥大的NMVCs中表达亦显著增加，见图1。

2MEF2C是miR-214 作用靶基因的验证

基于miRDB(www.mirdb.org)以及TargetScan-Vert (www.targetscan.org)的序列分析提示，MEF2C3’UTR的4 372～4 378碱基可能是miR-214的结合位点。双萤光素酶报告基因实验结果显示miR-214可特异地结合到MEF2C3’UTR的4 372～4 378位点，而突变结合区序列后，miR-214就不能与MEF2C3’UTR结合。RT-qPCR 和Western blot 法检测结果显示，MEF2C在Ang-II诱导的肥大NMVCs中表达明显增强，而miR-214 mimic和MEF2CsiRNA能一致性地在mRNA和蛋白水平抑制NMVCs中MEF2C表达，见图2。

3 过表达miR-214及沉默MEF2C可有效抑制心肌细胞肥大基因的表达

为从功能上鉴定过表达miR-214与抑制MEF2C对心肌细胞肥大的影响，分别将50 nmol/L miR-214 mimic和MEF2CsiRNA转染入Ang-II诱导的NMVCs中。Western blot结果显示，miR-214 mimic和MEF2CsiRNA能一致性地抑制Ang-II诱导NMVCs中ACTA1和β-MHC的表达增加，见图3。

Figure 1.miR-214 was increased in the myocardium of a mouse model of hypertrophy induced by Ang-II infusion. A: FITC-phalloidin staining assay; B: the mRNA expression of hypertrophy-related genes was determined by RT-qPCR; C: the protein expression of ANP, ACTA1 and β-MHC was determined by Western blot; D: the expression of miR-214 was assessed by RT-qPCR. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank group.

图1 miR-214在Ang-II诱导的肥厚小鼠心肌中表达增强

讨 论

近期研究发现，miR-214在小鼠心肌缺血再灌注时的表达显著升高；而miR-214敲除小鼠在缺血再灌注损伤7 d 后发生心肌肥厚和心肌纤维化程度明显加重。机制研究证实，miR-214可通过抑制钠钙交换体1(Na+/Ca2+exchanger 1，Ncx1)而抑制Ca2+通道功能，从而抑制缺血损伤所致的Ca2+超载及细胞死亡，进而有效抑制小鼠缺血性心肌损伤，发挥心肌保护作用[14]。miR-214在H2O2处理的心肌细胞中亦表达上调，而PTEN是miR-214的作用靶基因，并介导miR-214发挥抗H2O2所致的心肌细胞凋亡作用[15]。

既往研究显示miR-214也参与了心肌肥厚的病理过程。在小鼠心肌细胞中过表达miR-214，能显著上调心肌肥厚标志物ANP、ACTA1及β-MHC表达，而EZH2可能介导了miR-214的促心肌肥厚作用；在miR-214的转基因小鼠心肌中ANP、ACTA1及β-MHC表达上调，并且抑制miR-214表达能有效下调横向主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，TAC)所致的ANP、ACTA1及β-MHC表达增加[16-17]。

本文中，我们证实miR-214在Ang-Ⅱ诱导肥大的小鼠心肌细胞中表达升高。双萤光素酶报告基因实验提示miR-214可与MEF2C 3’UTR特异性结合。而检测过表达miR-214的NMVCs中MEF2C水平发现，miR-214可在转录水平抑制MEF2C表达。进一步的功能性研究表明，miR-214和MEF2CsiRNA可一致性地抑制Ang-Ⅱ诱导的NMVCs中心肌肥大相关ACTA1和β-MHC表达。因此，上述结果证实MEF2C是miR-214的靶基因，并介导miR-214发挥抑制心肌肥大的作用。

肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)家族蛋白是一类具有调节功能的蛋白,包括MEF2A、2B、2C和2D[18-19]。MEF2C在心脏中高表达，作为心脏特异的转录因子参与心脏发育的各个过程，调节着心脏特异基因的表达，敲除后会对心脏及血管的发育造成严重不良影响[20-21]。而MEF2C也被证实参与心肌肥厚的过程，MEF2C在发生心肌肥厚时被激活并且表达上调[22]。当特异性抑制心肌MEF2C表达后，能够有效减轻压力负荷所至的小鼠左室肥厚[23]。本文结果也表明，MEF2C在Ang-II诱导肥大的心肌细胞中特异地表达升高，而沉默MEF2C表达可有效抑制Ang-II诱导的心肌细胞肥大。

本文结果提示miR-214可通过抑制MEF2C表达发挥抑制心肌细胞肥大的作用，与以往miR-214通过抑制EZH2发挥促进心肌细胞肥大的报道不一致[16-17]。目前关于EZH2调控心肌细胞肥大作用的观点尚不一致，有研究证实，增加EZH2稳定性和生物学功能可显著抑制心肌肥厚的发生[24]。

Figure 2.miR-214 modulated the expression of MEF2C at the transcriptional level. A: dual luciferase reporter assay; B: MEF2C expression in NMVCs exposed to Ang-Ⅱ; C: MEF2C expression in NMVCs treated with miR-214 mimic orMEF2CsiRNA. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vspGL3-promoter group;△P<0.05,△△P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsscramble group.

图2 miR-214在转录水平调控MEF2C表达

Figure 3.miR-214 andMEF2CsiRNA inhibited the expression of hypertrophy-related proteins in the NMVCs. The protein expression of ACTA1, β-MHC and MEF2C in NMVCs was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.##P<0.01vsblank group;*P<0.05,**P<0.01vsAng-II group.

图3 miR-214和MEF2CsiRNA抑制乳小鼠心肌细胞中肥厚相关基因表达

本文发现miR-214在肥大的心肌细胞表达上调，通过双萤光素酶报告基因实验、靶基因表达和相应功能性实验证实MEF2C是miR-214作用靶基因，介导miR-214发挥抗心肌细胞肥大作用。在后续研究中，我们将在小鼠整体水平，进一步明确miR-214对MEF2C表达和对心肌肥厚表型的调控作用。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

MEF2C mediates inhibitory effect of microRNA-214 on cardiomyocyte hypertrophy

TANG Chun-mei1, 2, ZHU Jie-ning2, ZHU Wen-si1, 2, LIN Qiu-xiong2, HU Zhi-qin1, 2, FU Yong-heng2, ZHANG Meng-zhen2, DENG Chun-yu2, TAN Hong-hong2, WU Shu-lin2, SHAN Zhi-xin1, 2

(1SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2GuangdongCardiovascularInstitute,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:zhixinshan@aliyun.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA-214 (miR-214) on cardiomyocyte hypertrophy and the expression of the potential target genes. METHODS: A cell model of hypertrophy was established based on angiotensin-Ⅱ (Ang-Ⅱ)-induced neonatal mouse ventricular cardiomyocytes (NMVCs). Dual luciferase reporter assay was performed to verify the interaction between miR-214 and the 3’UTR ofMEF2C. The expression of MEF2C and hypertrophy-related genes at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot, respectively.RESULTS: The expression of ANP, ACTA1, β-MHC and miR-214 was markedly increased in Ang-Ⅱ-induced hypertrophic cardiomyocytes. Dual luciferase reporter assay revealed that miR-214 interacted with the 3’UTR ofMEF2C, and miR-214 was verified to inhibit MEF2C expression at the transcriptional level. The protein expression of MEF2C was markedly increased in the hypertro-phic cardiomyocytes. Moreover, miR-214 mimic, in parallel toMEF2CsiRNA, inhibited the expression of hypertrophy-related genes in Ang-Ⅱ-induced NMVCs. CONCLUSION:MEF2Cis a target gene of miR-214, which mediates the effect of miR-214 on attenuating cardiomyocyte hypertrophy.

Cardiac hypertrophy; MicroRNA-214; MEF2C; Cardiomyocytes

1000- 4718(2016)08- 1345- 06

2016- 04- 05

2016- 05- 13

国家自然科学基金资助项目(No. 81270222；No. 81470439)；广东省自然科学基金资助项目(No. 2014A030313635)； 广东省医学研究基金资助项目 (No. A2015187)

R329.2+1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.001

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 020-83827812-51158； E-mail: zhixinshan@aliyun.com